昆蟲血細胞通過表達cathepsin L參與脂肪體的降解.pdf

1、研究背景及研究意義：
　　 全變態(tài)昆蟲的一生要經(jīng)歷多次蛻皮，包括幼蟲各齡期之間的蛻皮、末齡幼蟲到蛹的變態(tài)蛻皮、以及蛹到成蟲的羽化蛻皮。昆蟲蛻皮和變態(tài)主要受兩種激素的調(diào)控:蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenilehormone，JH)。這兩種激素相互作用，共同決定著昆蟲不同發(fā)育階段生理活動和形態(tài)變化。在沒有JH存在的情況下，20E啟動變態(tài)過程。在變態(tài)過程中，幼蟲的組織發(fā)生降解，而成蟲的組

2、織逐漸形成。在幼蟲組織降解過程中發(fā)現(xiàn)了血細胞的參與，但血細胞如何影響組織降解卻并不清楚。闡明血細胞與變態(tài)期幼蟲組織水解的關(guān)系，并探索血細胞中特異表達的蛋白cathepsinL的功能，可以闡明血細胞在變態(tài)期組織重建中的作用及機理。
　　 研究進展：
　　 昆蟲的血細胞被認為主要參與免疫反應(yīng)，包括在病原微生物周圍形成包囊和結(jié)節(jié)以及吞噬病原微生物，清除外源物質(zhì)，然而也有報道表明血細胞可以在昆蟲的生長發(fā)育以及變態(tài)過程的組織重建中

3、發(fā)揮重要作用。我們實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L在血細胞中特異表達，并在變態(tài)時期高表達，受蛻皮激素上調(diào)。在棉鈴蟲幼蟲進行RNA干擾沉默cathepsinL之后，導致循環(huán)的顆粒細胞減少，脂肪體中沒有顆粒細胞進入而不能降解，形成不正常的嵌合蛹，提示20E促進cathepsinL在血細胞中表達從而參與組織解體。
　　 存在的科學問題：
　　 雖然前人研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20E促進cathepsinL表達，決定顆粒細胞數(shù)量、進而決定

4、脂肪體降解，但cathepsinL在顆粒細胞中的功能及作用機理不清楚，干擾cathepsinL導致顆粒細胞減少的原因尚不清楚，血細胞進入脂肪體以及在脂肪體解體中的作用機理也需要進一步實驗證據(jù)。
　　 研究結(jié)果：
　　 針對存在的科學問題，本論文運用分子生物學和細胞生物學技術(shù)開展研究，取得如下結(jié)果：
　　 1.通過細胞形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)血細胞在變態(tài)過程中會發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為顆粒細胞數(shù)量增加，體積增大，且所含顆粒數(shù)

5、目增多，轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細胞。與此同時，漿血細胞的數(shù)量急劇減少。
　　 2.利用Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)cathepsinL在蛻皮變態(tài)過程中表達量顯著增加。免疫細胞化學結(jié)果顯示cathepsinL主要定位于顆粒細胞和漿血細胞的細胞質(zhì)中。
　　 3.通過血細胞進體外培養(yǎng)的方法，證明20E可以促進漿血細胞的鋪展，促進顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細胞并遷移粘附到鋪展的漿血細胞上。Westernblot顯示20E同時使cathepsi

6、nL上調(diào)表達。
　　 4.運用RNAi在體外培養(yǎng)的血細胞中干擾cathepsinL，導致大多數(shù)顆粒細胞漂浮死亡在培養(yǎng)液中，不能形成大顆粒細胞。同時漿血細胞的鋪展也受到了抑制。
　　 5.通過活細胞熒光標記血細胞后重新注射到蟲體內(nèi)，證明血細胞可以進入變態(tài)期的幼蟲脂肪體中，使脂肪體降解和水解。
　　 6.通過在棉鈴蟲表皮細胞系中過表達cathepsinL的蛋白酶功能域，發(fā)現(xiàn)其過表達可導致細胞凋亡，說明cathepsi

7、nL可通過蛋白酶活性參與脂肪體降解。
　　 7.變態(tài)時期血細胞凋亡率明顯增加，且凋亡細胞主要為顆粒細胞。
　　 8.CathepsinL可以在6th-96h和6th-120h幼蟲的血漿和脂肪體中檢測到，說明凋亡細胞可能將cathepsinL釋放到血漿中，并參與脂肪體的降解。
　　 結(jié)論及意義：
　　 本研究證明了棉鈴蟲顆粒細胞在變態(tài)時期數(shù)量增加并轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細胞;cathepsinL在變態(tài)期高表達，主要分

8、布在顆粒細胞及漿血細胞中;20E促進cathepsinL表達和顆粒細胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化;干擾cathepsinL之后導致20E激素不能促進顆粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇箢w粒細胞而死亡;變態(tài)時期的血細胞可以進入到幼蟲脂肪體中;棉鈴蟲表皮細胞系中過表達cathepsinL可以引起細胞凋亡;變態(tài)時期血細胞凋亡率增加，;凋亡的血細胞可以釋放cathepsinL到血漿中參與組織的降解。
　　 本研究闡明了血細胞在昆蟲變態(tài)過程的組織重建中發(fā)揮作用，其作用機理是