Cathepsin L通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路影響腫瘤細(xì)胞輻射敏感性.pdf

1、目的：研究在X射線作用后人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中溶酶體組織蛋白酶L(Cathepsin L，CTSL)的表達(dá)及其在電離輻射誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活過程中的作用，進(jìn)一步探討Cathepsin L對腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響及其可能機制。
　　方法：在已建立的U251細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)Cathepsin L穩(wěn)定低表達(dá)NF-κB的U251和MCF-7細(xì)胞株，用X

2、射線和/或Cathepsin L特異性抑制劑Z-FY-CHO處理細(xì)胞，采用Western Blot法檢測各處理組中細(xì)胞Cathepsin L蛋白的表達(dá)和NF-κB的核轉(zhuǎn)位水平，免疫熒光法檢測各處理組細(xì)胞中的NF-κB的胞內(nèi)分布情況，雙熒光素酶報道基因法測定各處理組中NF-κB調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的改變，染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）法顯示NF-κB入核后參與調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活水平，堿性彗星試驗反映輻射后DNA的損傷修復(fù)情況；克隆形成實驗

3、檢測各處理組細(xì)胞的輻射敏感性差異。
　　結(jié)果：X射線可誘導(dǎo)U251和MCF-7細(xì)胞中Cathepsin L活性片段表達(dá)及NF-κB核轉(zhuǎn)位水平的升高。Western Blot、免疫熒光和熒光素酶報告基因檢測顯示，通過不同方法抑制Cathepsin L后，X射線誘導(dǎo)的NF-κB激活受到一定程度的阻滯。ChIP結(jié)果顯示抑制Cathepsin L后，X射線誘導(dǎo)的NF-κB與靶基因cyclin D1和ATM啟動子的結(jié)合水平也相應(yīng)降低。同時，

4、Cathepsin L表達(dá)被抑制后再經(jīng)X射線處理的U251和MCF-7細(xì)胞與單純X射線處理的細(xì)胞相比克隆形成率降低。進(jìn)一步建立穩(wěn)定低表達(dá)NF-κB p65亞基的細(xì)胞株進(jìn)行堿性彗星實驗和克隆形成實驗，結(jié)果顯示X射線作用后低表達(dá)p65的細(xì)胞的DNA損傷不易被修復(fù)，克隆形成率明顯降低，而使用Cathepsin L處理不能增加細(xì)胞的輻射敏感性。
　　結(jié)論：Cathepsin L在一定程度上參與了X射線對NF-κB的激活，抑制Catheps