體外多酶催化確定乳酸合成途徑關(guān)鍵酶的研究.pdf

1、代謝途徑中的關(guān)鍵酶往往決定反應(yīng)的速度，所以關(guān)鍵酶的研究對于代謝途徑的優(yōu)化具有重要的作用，而糖酵解途徑是一切生物有機體中普遍存在的葡萄糖降解途徑，為其他代謝途徑提供中間代謝產(chǎn)物，本文研究的乳酸合成途徑包括糖酵解途徑和乳酸脫氫酶。本研究基于代謝控制分析理論提出了一種通過體外代謝途徑構(gòu)建和分析確定關(guān)鍵酶的方法，并應(yīng)用其確定乳酸高產(chǎn)菌株中的關(guān)鍵酶。首先獲得高產(chǎn)菌株的粗酶液并測定葡萄糖到乳酸合成途徑中各種蛋白的絕對濃度，進而通過向粗酶液中分別添加

2、同等比例的各純酶對途徑進行擾動，并由擾動前后的途徑通量變化計算出各酶的通量控制系數(shù)以確定途徑關(guān)鍵酶。通過上述方法本文獲得了如下主要研究結(jié)果:
　　本文成功構(gòu)建并表達了乳酸合成途徑相關(guān)蛋白，經(jīng)蛋白純化得到純酶，通過適合的酶偶聯(lián)反應(yīng)測定蛋白活性，在測定中發(fā)現(xiàn)果糖二磷酸醛縮酶(FbaA)能夠代替甘油酸磷酸激酶(Pgk)催化甘油酸-1，3-二磷酸到甘油酸-3-磷酸，且發(fā)現(xiàn)這兩個基因有相同的操縱子，而Pgk是必需基因，所以FbaA新功能的發(fā)

3、現(xiàn)有一定的研究意義，在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)底物濃度與酶濃度獲得乳酸合成途徑各蛋白的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km及比酶活，為后續(xù)實驗提供依據(jù);
　　通過向粗酶液中添加純酶改變催化反應(yīng)速率的方法，對乳酸高產(chǎn)菌株粗酶液中乳酸合成途徑各蛋白進行絕對定量，確定粗酶中含有37.8mg/L葡糖激酶(Glk)，107mg/L葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(Pgi)，78.7mg/果糖磷酸激酶(PfkA)，262.3mg/L果糖二磷酸醛縮酶(FbaA)，63.4mg/L甘油醛磷酸

4、異構(gòu)酶(TpiA)，1457mg/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GapA)，806mg/L甘油酸磷酸激酶(Pgk)，6.7mg/L丙酮酸激酶(PykA)，316.1mg/L乳酸脫氫酶(Ldh)，對胞內(nèi)乳酸合成途徑蛋白比例有一定認識，通過進一步向粗酶液中分別添加同等比例的各種純酶對途徑進行擾動，測定途徑達到準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)時的通量變化，計算各酶的通量控制系數(shù)Glk為0.14，Pgi為0.47，PfkA為0.35，F(xiàn)baA為0.35，TpiA為0.27，