丹參迷迭香酸合成途徑關(guān)鍵酶基因的鑒定與分析.pdf

1、丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為《中國藥典》所記載的一種藥用植物，也是我國被國際市場大量引進(jìn)的一種重要中藥材。因其富含脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物（丹酚酸、紫草酸、迷迭香酸等）等次生代謝物質(zhì)而具備抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌消炎、降血脂等多種藥理活性。丹參中所富含的各種化合物中以迷迭香酸和丹酚酸B抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等活性最為突出并具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。植物次生代謝物質(zhì)在植物體內(nèi)含量一般較低，

2、且易受外界環(huán)境的影響，為此，如何利用基因技術(shù)手段人為地改變藥用植物代謝流，促進(jìn)特定化合物的定向合成，以提高藥用植物中特定化合物的產(chǎn)量已成為許多學(xué)者們關(guān)注和研究的焦點(diǎn)，但首要的基底工作為揭示清楚藥用植物體內(nèi)控制目標(biāo)化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。基于此，進(jìn)一步揭示丹參中迷迭香酸生物合成途徑中相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，以期為丹參迷迭香酸代謝途徑的解析和定向改造提供些許科學(xué)依據(jù)。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上通過對丹參基因組數(shù)據(jù)庫的分析比對，初步篩選鑒定出了

3、28個(gè)與丹參迷迭香酸生物合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，其中，有20個(gè)新基因，并克隆了其中2個(gè)基因的全長序列，對所有基因的表達(dá)模式進(jìn)行了詳細(xì)分析，探討了丹參迷迭香酸生物合成途徑中各關(guān)鍵酶基因與次生代謝物合成之間的關(guān)系，并構(gòu)建了RAS1基因的人工miRNA表達(dá)載體，結(jié)果如下:
　　 1.利用丹參迷迭香酸合成途徑中已報(bào)道的PAL1、PAL2、4CL1、4CL2、C4H1、TAT1、HPPR1和RAS1基因的蛋白序列及擬南芥的相關(guān)序列，在丹

4、參數(shù)據(jù)庫里blastx比對分析預(yù)測出共28個(gè)與丹參迷迭香酸合成途徑相關(guān)的酶基因。
　　 2.在以上序列預(yù)測的基礎(chǔ)上，利用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，結(jié)合RT-PCR技術(shù)，對丹參部分序列未知的PAL2基因和未報(bào)道的PAL3基因克隆獲得了全長序列。其中，克隆出SmPAL2基因cDNA5'末端514bp，380bp為未知的cDNA序列，134bp為5'-UTR

5、部分;克隆出SmPAL3基因5'和3'-UTR序列分別為153bp和197bp，SmPAL3基因的全長序列為2127bp。
　　 3.基于序列預(yù)測結(jié)果，利用生物信息學(xué)的方法分析了所有基因的基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了這些家族基因的組織特異性表達(dá)情況?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明:丹參PAL、4CL、C4H、TAT、HPPR和RAS基因家族的成員的內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目各不相同，說明它們基因的結(jié)構(gòu)類型非常豐富

6、，而且所有基因外顯子-內(nèi)含子剪接跟其他物種一致均遵循GT-AG的規(guī)則。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果顯示:SmPALs家族基因在進(jìn)化上可明顯分為兩個(gè)亞族，SmPAL1和SmPAL3為一個(gè)亞族，SmPAL2為另一亞族;SmTATs家族基因進(jìn)化分析顯示被分成兩個(gè)亞族，SmTAT1和SmTAT2為一亞族，SmTAT3和SmTAT4為另一亞族。這些這些基因家族在進(jìn)化上具有高度的保守性，說明其具有共同的祖先。熒光定量表達(dá)結(jié)果表明:SmPAL1和SmPAL3

7、在根和葉中表達(dá)較高，而SmPAL2在莖和花中顯著表達(dá);Sm4CL2和Sm4CL3在莖中顯著表達(dá)，在根和葉中Sm4CL5顯著表達(dá);SmC4H1在根、莖、葉和花四個(gè)部位均大量表達(dá);SmTAT1和SmTAT4主要在根中表達(dá)，SmTAT2和SmTAT3主要在花和葉中表達(dá);SmHPPR1和SmHPPR4在各個(gè)部位的表達(dá)量均較其他兩個(gè)基因高，而SmHPPR4在根中的表達(dá)較為顯著。對于SmRASs，根中SmRAS1表達(dá)量最高，莖中SmRAS4的表達(dá)量