堿性蛋白酶抑制劑LupI-MSSS的原核表達(dá)、純化及晶體條件初篩.pdf

1、沙雷氏蛋白酶基因在產(chǎn)生該酶基因的菌株基因組中都有一個抑制該蛋白酶活性的基因位于其上游或者下游。低溫堿性金屬蛋白酶MP是從菌株YS-80-122中提取純化的，屬于沙雷氏蛋白酶家族，與該家族報道的其他酶的結(jié)構(gòu)類似，氨基酸同源性最高為83％。在MP基因下游有一抑制劑基因lupI，與現(xiàn)有假單胞桿菌蛋白酶抑制劑APRin的氨基酸同源性為55%，該抑制劑可以完全抑制蛋白酶MP的活性。為進(jìn)一步探究N端序列延伸后對抑制劑活性的影響，在野生型抑制劑基因的

2、基礎(chǔ)上，通過定點(diǎn)突變將LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，本實驗對抑制劑基因lupI-MSSS在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)；并通過單因素法和響應(yīng)面法相結(jié)合對該抑制劑的發(fā)酵表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化；同時對表達(dá)后的蛋白進(jìn)行了純化以滿足后續(xù)結(jié)晶的純度要求；最后對抑制劑LupI-MSSS的結(jié)晶條件進(jìn)行了初篩，研究結(jié)果分述如下：
　　抑制劑LupI-MSSS在大腸桿菌中的表達(dá)：利用定點(diǎn)突變試劑盒設(shè)計合成兩端引物，以 LupI野生型表達(dá)質(zhì)粒

3、 pET28-lupI為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，構(gòu)建pET28a-lupI-MSSS原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行培養(yǎng)。挑選陽性單克隆進(jìn)行雙酶切驗證，酶切后表達(dá)片段約為363 bp，與預(yù)期一致。將表達(dá)正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。菌液重懸破碎后留上清，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果表明該蛋白的大小約11 KDa，與預(yù)測的蛋白分子質(zhì)量相同，同時活性測定也表明表達(dá)的該抑制劑可以完全

4、抑制堿性蛋白酶MP的活性。
　　抑制劑LupI-MSSS在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化：采用單因素試驗對重組大腸桿菌表達(dá)抑制劑LupI-MSSS的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件（初始培養(yǎng)基pH、接種量、誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)劑終濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、搖床轉(zhuǎn)速）進(jìn)行了優(yōu)化，并針對以上七個因素，利用Plackett-Burman試驗篩選出3個主要影響因子：誘導(dǎo)劑添加時間、誘導(dǎo)劑終濃度、誘導(dǎo)時間。利用響應(yīng)面試驗對以上三個主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定的發(fā)酵表達(dá)

5、條件為：初始培養(yǎng)基pH為7，接種量2%，誘導(dǎo)劑添加時間2 h，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時間為8.5 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。
　　抑制劑LupI-MSSS的純化：發(fā)酵制備抑制劑粗蛋白液，經(jīng)過三步純化：超濾、Superdex200凝膠過濾層析和Q-Sepharose離子交換層析。最終純化得到的樣品純化倍數(shù)為20，回收率為60.7%，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示為單一的目的條帶。通過H

6、PLC法對蛋白樣品的純度進(jìn)行鑒定，其純度高達(dá)99.7%，達(dá)到預(yù)期要求，可供后續(xù)結(jié)晶試驗使用。
　　抑制劑LupI-MSSS結(jié)晶條件初篩：利用Hampton Research的試劑盒對抑制劑LupI-MSSS的晶體生長條件進(jìn)行了初篩。HR2-144 Index試劑盒，20℃培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其中22個條件下都有晶體生長，且晶型較一致。挑取狀態(tài)較好的單晶進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有目的條帶存在，說明顯微鏡下觀察到的晶體確實為抑制劑蛋白結(jié)