煙粉虱絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin的克隆、原核表達(dá)及表達(dá)分析.pdf

1、煙粉虱（Bemisia tabaci）的寄主范圍廣泛，對(duì)化學(xué)農(nóng)藥抗性較強(qiáng)，是世界重大入侵害蟲(chóng)之一，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin負(fù)調(diào)控蛋白酶介導(dǎo)的一系列生命進(jìn)程，在昆蟲(chóng)中主要起到抑制過(guò)度黑化反應(yīng)的作用，在昆蟲(chóng)的先天免疫反應(yīng)中起到重要作用。為了基于煙粉虱的免疫系統(tǒng)，闡明免疫相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能，并且研制以免疫通路為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥來(lái)防治煙粉虱。本研究用分子生物學(xué)技術(shù)，根據(jù)煙粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)預(yù)測(cè)為putative s

2、erine protease inhibitor4的Unigene CL1572.Contig3_B序列，通過(guò)RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆獲得cDNA全長(zhǎng)。應(yīng)用熒光定量 PCR技術(shù)研究了 Serpin基因在煙粉虱中的齡期表達(dá)特異性，并以大腸桿菌（Escherichia coli）為載體，在體外進(jìn)行了原核表達(dá)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1、利用reverse transcription PCR(RT-PCR)和rapi

3、d amplification of cDNA ends(RACE)技術(shù)，對(duì)煙粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的Serpin基因unigene片段進(jìn)行克隆，獲得了煙粉虱Serpin基因的cDNA全長(zhǎng)。并將全長(zhǎng)序列上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為No. KT326952。Serpin的cDNA全長(zhǎng)為1899 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為1206bp，共編碼401個(gè)氨基酸，將預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)的Serpin氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

4、，發(fā)現(xiàn)它們與同為半翅目的柑橘木虱（Diaphorina citri）和褐飛虱（Nilaparvata lugens）有較高的同源性。
　　2、為闡明煙粉虱Serpin基因在核酸水平上的表達(dá)模式，本研究通過(guò)real time quantity PCR(qRT-PCR)檢測(cè)其在卵、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，Serpin基因在煙粉虱的所有齡期都有表達(dá)。在卵期和成蟲(chóng)期表達(dá)量顯著高于其他齡期；在4齡若蟲(chóng)表達(dá)量顯著低于其他齡期。結(jié)果表

5、明，Serpin在煙粉虱中具有齡期表達(dá)特異性。
　　3、本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a-Serpin，在大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)。SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)表明pET-32a-Serpin表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為45kDa的蛋白。用Ni-NTA親合層析和膠回收純化了Serpin蛋白，為Serpin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了蛋白資源。用純化的蛋白免疫動(dòng)物，制備了多克隆抗體，以制備的