光周期響應(yīng)基因StH2A調(diào)控生長(zhǎng)功能研究.pdf

1、不同植物對(duì)光周期響應(yīng)不同，目前關(guān)于植物如何在分子水平響應(yīng)光周期知之甚少。本論文以不同光周期處理的馬鈴薯葉片為材料，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了不同光周期處理的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜;分析了表達(dá)譜數(shù)據(jù)，識(shí)別和篩選了光周期響應(yīng)基因，克隆了光周期響應(yīng)基因StH2A的全長(zhǎng)cDNA，基因工程途徑實(shí)現(xiàn)了反義StH2A cDNA在本氏煙體內(nèi)表達(dá)，確定了H2A參與頂端優(yōu)勢(shì)維持和調(diào)控開花的功能，具體研究結(jié)果如下:
　　1.經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、GO功能注釋和差異表達(dá)基因分析，篩

2、選了208個(gè)注釋為“核酸結(jié)合蛋白”的差異基因。結(jié)合不同光周期這些基因的RPKM表達(dá)量變化，篩選了20個(gè)顯著隨光周期變化表達(dá)的目的基因，qRT-PCR證實(shí)了其隨光周期的表達(dá)動(dòng)態(tài)，由此確定了對(duì)注釋為H3.2、H2A和TP的基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　2.克隆了H3.2、H2A、TP基因的全長(zhǎng)cDNA;為了實(shí)現(xiàn)各自編碼基因體內(nèi)過量或抑制表達(dá)，亞克隆途徑，得到基因工程重組菌株DH5α-pC-35S-H3.2+/-、DH5α-pC-35S-H

3、2A+/-、DH5α-pC-35S-TP+/-及GV3101-pC-35S-H3.2+/-、GV3101-pC-35S-H2A+/-、GV3101-pC-35S-TP+/-。
　　3.采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)途徑，轉(zhuǎn)化反義StH2A于本氏煙，篩選獲得本氏煙突變株系h2a-2，h2a-2表現(xiàn)出頂端優(yōu)勢(shì)缺失和開花延遲的表型;H2A蛋白ELISA測(cè)定結(jié)果顯示，h2a-2株系葉片H2A蛋白含量比WT下降23.7％，表明反義StH2A本氏煙體內(nèi)表

4、達(dá)抑制了本氏煙NbH2A的積累。
　　4.本氏煙基因組數(shù)據(jù)庫檢索，識(shí)別了CONSTANS(CO)，F(xiàn)LOWING LOCUS T(FT)和EARLYFLOWERING4(ELF4)3個(gè)成花基因，依據(jù)其核酸序列設(shè)計(jì)各自特異引物，葉片mRNA為模版，RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照株系比較，h2a-2株系3個(gè)成花基因mRNA積累呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達(dá)，表明NbH2A參與了3個(gè)成花基因的轉(zhuǎn)錄，CO，F(xiàn)T與ELF4間通過H2A彼此聯(lián)系。

5、>　　5.檢索本氏煙基因組數(shù)據(jù)庫，識(shí)別了22個(gè)NbH2A編碼基因，序列對(duì)比和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，其中4個(gè)NbH2A與本研究克隆的StH2A預(yù)測(cè)的氨基酸序列高度相似，且具有N端多聚丙氨酸基序，反義StH2A至少抑制了N端多聚丙氨酸NbH2A的表達(dá)。
　　6.不同NbH2A基因RT-PCR結(jié)果顯示，h2a-2株系葉片多聚丙氨酸NbH2A mRNA積累明顯少于對(duì)照，其它非多聚丙氨酸NbH2A基因mRNA積累明顯多于對(duì)照，表明其它NbH2A基