玉米光周期敏感基因類Hd6的克隆和功能分析.pdf

1、熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)具有豐富的遺傳變異，是拓寬我國玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)和提升育種水平的一個重要途徑。然而，玉米光周期敏感是熱帶、亞熱帶種質(zhì)利用的一個主要障礙。因此，分離、克隆控制玉米光周期敏感相關(guān)基因并探知其功能，進(jìn)而揭示光周期敏感的遺傳特性和內(nèi)在分子機(jī)制，對熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的有效利用，以及對植物花發(fā)育生物學(xué)機(jī)理研究的深入，均具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究以熱帶玉米自交系CML288為材料，利用同源克隆法結(jié)合3’RACE技術(shù)克隆了與水

2、稻Hd6基因同源的玉米類Hd6基因。利用熒光定量PER技術(shù)研究了不同光周期處理下類Hd6基因在光周期敏感自交系CML288莖尖和葉片中的表達(dá)，并且設(shè)計(jì)了SD(短日照)下的暗期光間斷實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測類Hd6基因在暗期光間斷后的表達(dá)變化趨勢。構(gòu)建了類Hd6基因的過量表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌浸染花序法將其轉(zhuǎn)入了擬南芥，觀察了轉(zhuǎn)化株的表型并分析了擬南芥光周期相關(guān)基因的表達(dá)，對類Hd6基因的功能和作用機(jī)制進(jìn)行了探索。主要研究結(jié)果如下： 1.利用同源

3、克隆結(jié)合RACE技術(shù)，首次成功克隆了玉米類Hd6基因的編碼序列，GeneBank登錄號為EF114229。該基因序列中999bp的開放閱讀框可編碼332個氨基酸。BIAST分析發(fā)現(xiàn)，該基因與玉米中編碼蛋白激酶CK2的一個基因高度同源，所推測的氨基酸序列與小麥、水稻和擬南芥的CK2氨基酸序列的同源性分別為95％，96％和92％；序列包含2個CK2活性區(qū)域，1個N末端區(qū)域，1個ATP結(jié)合位點(diǎn)和1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶活性位點(diǎn)，具備蛋白激

4、酶CK2α的典型功能區(qū)域，能夠編碼蛋白激酶CK2的α亞基。 2.建立了SYBR GREEN法實(shí)時熒光定量RT-PCR表達(dá)分析系統(tǒng)。類Hd6基因表達(dá)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在莖尖和葉片中均有表達(dá)。在短日條件下，該基因在6-8葉期莖尖中的表達(dá)量存在明顯差異，在光周期敏感的7葉期出現(xiàn)表達(dá)高峰，在葉片中的表達(dá)量均低于莖尖；在長日條件下，該基因在莖尖中6葉期表達(dá)量較低，在光周期敏感的9葉期在葉片中高量表達(dá)；基因的表達(dá)高峰期均與前期研究的CML

5、288進(jìn)行花發(fā)育以及光周期敏感的時期相吻合；顯示類Hd6基因參與了玉米光周期途徑以及雄花分化的過程。對SD下的CML288進(jìn)行暗期光間斷后，類Hd6基因的表達(dá)量在莖尖和葉片中均明顯下降；光間斷處理的天數(shù)越多，類Hd6基因的表達(dá)量越低；伴隨著類Hd6表達(dá)量的下降，玉米雄花分花被抑制。類Hd6是一個能夠調(diào)節(jié)玉米光周期敏感性的基因，并可能通過某種途徑參與Pfr或Pr光敏色素對光周期中央振蕩器的調(diào)節(jié)，能夠維持對暗期效應(yīng)的感知，促進(jìn)玉米開花。

6、 3.成功構(gòu)建了玉米類Hd6基因的過量表達(dá)載體PBI-HD6，得到擬南芥過量表達(dá)植株hd6-ox。類Hd6基因的導(dǎo)入使擬南芥的花期推遲24天左右。在hd6-ox中，導(dǎo)入的類Hd6基因出現(xiàn)震蕩式表達(dá)節(jié)奏，并使中央振蕩器基因TOC1基因的表達(dá)高峰延遲，GI、CO和FT基因均在光照3h后出現(xiàn)異常的表達(dá)高峰，并且CO與FT的表達(dá)在夜間出現(xiàn)震蕩。表明類Hd6基因與光周期振蕩器十分接近，LD下類Hd6基因的導(dǎo)入能造成振蕩器紊亂，并以一種未知的途