環(huán)氧化物水解酶穩(wěn)定性研究及其在兩相體系中制備手性環(huán)氧氯丙烷的應(yīng)用.pdf

1、手性環(huán)氧氯丙烷是一種重要C3的手性合成子，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和材料等領(lǐng)域。利用環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH，EC3.3.2.3)立體選擇性水解外消旋環(huán)氧氯丙烷(rac-ECH)，是生產(chǎn)手性環(huán)氧氯丙烷的一種有效途徑。
　　本論文在實驗室前期環(huán)氧化物水解酶篩選、基因工程菌構(gòu)建及分子改造基礎(chǔ)上，利用所獲得的突變體酶為研究對象，著重研究了離子液體體系中環(huán)氧化物水解酶生物拆分環(huán)氧氯丙烷，并探索了利用化學(xué)糖基化修

2、飾策略提高環(huán)氧化物水解酶的穩(wěn)定性，以及考察了全細胞環(huán)氧化物水解酶的交聯(lián)固定化工藝，具體研究結(jié)果如下:
　　首先，研究了離子液體/緩沖液兩相體系中環(huán)氧化物水解酶全細胞催化拆分環(huán)氧氯丙烷的過程。確定了最佳離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM][PF6])，水相與[BMIM][PF6]體積比為4∶1，緩沖液pH8.0，最適溫度35℃。當菌體濃度為0.02g/mL，底物濃度可達1mol/L，反應(yīng)時間約45min，(R)-

3、ECH的e.e.值和收率分別達到最大值98.4％和38.2％，時空產(chǎn)率為0.51mol/L/h，催化劑效率達23.9mmol/g。當增加菌體濃度至0.04g/mL，最大底物濃度可達1.2mol/L。
　　其次，為了提高環(huán)氧化物水解酶的穩(wěn)定性，對其進行化學(xué)糖基化修飾，確定了用胺化葡聚糖與酶液通過碳二亞胺偶合的修飾方法?？疾炝擞闷暇厶?0kDa修飾后的環(huán)氧化物水解酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和變性劑耐受性。與原始酶相比，發(fā)現(xiàn)修飾酶的這些性

4、質(zhì)都有一些改善，其中，在50℃時其半衰期較原始酶提高了28％。之后，還考察了修飾酶在[BMIM][PF6]/緩沖液兩相體系中的催化反應(yīng)。
　　最后，對環(huán)氧化物水解酶全細胞進行固定化研究，經(jīng)過對不同載體篩選確定了采用PEI-GA交聯(lián)法固定化細胞效果最好，且其制備的最佳條件為:聚乙烯亞胺3％(v/v)，戊二醛1％(v/v)，硅藻土0.6％(w/v)。此外，研究發(fā)現(xiàn)固定化細胞最適反應(yīng)溫度為40℃，pH8.0，與游離細胞相比，其熱穩(wěn)定性、