可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑調(diào)節(jié)miRNA-1作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　培養(yǎng)原代乳小鼠心肌細(xì)胞，用經(jīng)過(guò)特殊化學(xué)修飾的微小RNA-1（microRNA-1，miRNA-1）激動(dòng)劑ago-miRNA-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以構(gòu)造miRNA-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，從而模擬缺血性心律失常的病理狀態(tài)。以與心律失常密切相關(guān)的KCNJ-2、GJA-1基因表達(dá)及其編碼的內(nèi)向整流性鉀通道2.1（inwardly rectifying potassium2.1，Kir2.1）及細(xì)胞間縫隙連接蛋白43(Connexin43，

2、Cx43)蛋白為指標(biāo)，觀察不同濃度的可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxide hydrolase inhibitor,sEHi) trans-4-[4-(3-adamantan-1-ylureido)-cyclohexyloxy]-benzoic acid（t-AUCB）對(duì)其影響。本研究探討t-AUCB對(duì)缺血性心律失常的作用及可能機(jī)制，有利于開(kāi)拓對(duì)sEHi的認(rèn)識(shí)，并為臨床缺血性心律失常的防治提供新思路。
　　方法

3、：
　　選取新生一天的昆明小鼠，斷頭取心臟，將心臟剪碎后用胰酶反復(fù)消化，收集細(xì)胞懸液，再離心收集細(xì)胞，加入MEM5完全細(xì)胞培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用差速貼壁及化學(xué)法兩種方法抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，以純化心肌細(xì)胞。24小時(shí)后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及搏動(dòng)的變化情況，并針對(duì)心肌細(xì)胞胞漿中特異的橫紋肌肌動(dòng)蛋白進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，鑒定原代乳小鼠心肌細(xì)胞的純度。
　　構(gòu)建miRNA-1激動(dòng)劑ago-miRNA-1，待心肌細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，選

4、用200nM濃度轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，以構(gòu)造miRNA-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，以錯(cuò)序的ago-miRNA-1-NC作為陰性對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Realtime-PCR)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功。
　　將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為以下幾組:(1)空白對(duì)照組:心肌細(xì)胞不做任何轉(zhuǎn)染及藥物處理。(2) ago-miRNA-1轉(zhuǎn)染組:心肌細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，200nM ago-miRNA-1轉(zhuǎn)染48小時(shí)。(3)ago-miRNA-1-NC轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組:心肌

5、細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，200nM ago-miRNA-1-NC轉(zhuǎn)染48小時(shí)。(4) ago-miRNA-1轉(zhuǎn)染+t-AUCB干預(yù)組（濃度梯度干預(yù)）:心肌細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染200nM ago-miRNA-148小時(shí)，再加入不同濃度的t-AUCB干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)。通過(guò)Realtime-PCR測(cè)定不同分組心肌細(xì)胞的miRNA-1及KCNJ-2、GJA-1的mRNA表達(dá)，免疫印跡法(Western Blot)測(cè)定心肌細(xì)胞的Kir2.1及Cx

6、43蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的原代乳小鼠心肌細(xì)胞貼壁，形態(tài)多樣，呈簇生長(zhǎng)，有明顯搏動(dòng)，純度達(dá)到95％左右。
　　2.200nM ago-miRNA-1為最適宜轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞濃度，且ago-miRNA-1組miRNA-1相對(duì)表達(dá)量為38.19±3.92，與空白對(duì)照組（control）相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。用ago-miRNA-1結(jié)構(gòu)相似的ago-miRNA-1-NC（200nM）作為陰性對(duì)照

7、，轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞miRNA-1相對(duì)表達(dá)量為1.80±0.37，與空白對(duì)照組(control)相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，表明miRNA-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。
　　3.與空白對(duì)照組（control）相比，ago-miRNA-1組miRNA-1相對(duì)表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;ago-miRNA-1-NC組miRNA-1表達(dá)與空白對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異(P＞0.05)。藥物干預(yù)組運(yùn)用t-AUCB2，5，10

8、，20μM后，結(jié)果顯示t-AUCB可呈濃度依賴(lài)性降低已構(gòu)建的miRNA-1過(guò)表達(dá)的乳小鼠心肌細(xì)胞中miRNA-1的表達(dá)。乳小鼠心肌細(xì)胞的miRNA-1相對(duì)表達(dá)量分別為0.62±0.10，0.46±0.05，0.36±0.03，0.28±0.04，與ago-miRNA-1組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（all P＜0.05）。
　　4.與空白對(duì)照組(control)相比， ago-miRNA-1組GJA-1及KCNJ-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

9、明顯下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);ago-miRNA-1-NC組GJA-1、KCNJ-2 mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異(P＞0.05)。藥物干預(yù)組使用t-AUCB2，5，10，20μM，結(jié)果顯示t-AUCB可呈濃度依賴(lài)性增加已構(gòu)建的miRNA-1過(guò)表達(dá)的乳小鼠心肌細(xì)胞中GJA-1、KCNJ-2 mRNA的表達(dá)。乳小鼠心肌細(xì)胞的GJA-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.16±0.05，1.31±0.09，1.52±0.0

10、9，1.58±0.09; KCNJ-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.14±0.04，1.21±0.04，1.39±0.04，1.40±0.04，與ago-miRNA-1組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(all P＜0.05)。
　　5.Western Blot檢測(cè)Cx43與Kir2.1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，ago-miRNA-1組蛋白表達(dá)明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);ago-miRNA-1-NC組蛋白表達(dá)與空白對(duì)

11、照組相比，無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與ago-miRNA-1組相比，ago-miRNA-1+t-AUCB2，5，10，20μM組呈濃度依賴(lài)性升高已構(gòu)建的miRNA-1過(guò)表達(dá)的乳小鼠心肌細(xì)胞中Cx43與Kir2.1蛋白的表達(dá)，除t-AUCB2μM組Kir2.1蛋白升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余組升高均達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.采用低濃度胰蛋白酶消化，結(jié)合差速貼壁及化學(xué)抑制兩種方法，可以提高乳小鼠心肌細(xì)胞的

12、成活率及純度。
　　2.200nM ago-miRNA-1為最適宜轉(zhuǎn)染濃度，與空白對(duì)照組相比，ago-miRNA-1組乳小鼠心肌細(xì)胞miRNA-1相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而ago-miRNA-1-NC組無(wú)明顯差異，表明miRNA-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。
　　3.t-AUCB可呈濃度依賴(lài)性地降低已構(gòu)建的miRNA-1過(guò)表達(dá)的乳小鼠心肌細(xì)胞中miRNA-1的表達(dá)。另外，t-AUCB可呈濃度依賴(lài)性升高已構(gòu)建的miRNA-1過(guò)表達(dá)的