可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑AUDA在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:心腦血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是導(dǎo)致人類致殘、致死的主要原因，為嚴(yán)重威脅人類健康的流行病。而動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)能夠引起心肌梗塞和腦梗塞，是心腦血管疾病發(fā)生的最主要原因之一。對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的有效預(yù)防及對(duì)其進(jìn)展的合理控制是心血管病的預(yù)防和治療的關(guān)鍵所在。研究證實(shí)環(huán)氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)可通過抗炎作用對(duì)血

2、管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病進(jìn)行預(yù)防。而可溶性環(huán)氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase，sEH)能夠?qū)ETs轉(zhuǎn)化為生物活性較低的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids，dHET)，從而降低EETs抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。因此，抑制sEH能夠減少EETs的降解并有效延長(zhǎng)它們的作用時(shí)間，更大程度上發(fā)揮EETs對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用?？扇苄原h(huán)氧水解酶抑制劑(sEHinhibito

3、rs)不僅能夠在高血壓大鼠中有效的降低血壓，而且能夠在小鼠敗血癥模型中顯著降低炎癥反應(yīng)，并且有證據(jù)表明可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑能夠在炎癥性疼痛中表現(xiàn)出抗疼痛的作用。由于可溶性環(huán)氧水解酶在心臟中廣泛表達(dá)并在一些疾病模型中表現(xiàn)出抗炎癥的作用，而動(dòng)脈粥樣硬化也是一種炎癥性的血管疾病，本研究擬嘗試使用可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病進(jìn)行治療并探討其可能的機(jī)制。
　　研究目的:明確可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑12-（3-金剛烷-脲基）月桂酸

4、衍生物[12-(3-adamantan-1-yl-ureido) dodecanoic acid, AUDA]是否具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用，并探討其作用機(jī)制，為AUDA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本論文擬從以下兩部分展開研究:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的療效分析:建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，為下一步研究提供模型基礎(chǔ);優(yōu)化可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA的作用濃度，并評(píng)估其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的治

5、療效應(yīng)。
　　2.探討可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的療效分析:
　　(1)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的建立:選用8周齡的ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠，高脂飲食兩周后，行頸動(dòng)脈縮窄手術(shù)模擬血管狹窄，繼續(xù)給予高脂飲食分別至16周和24周。同品系的C57BL/6野生型小鼠作為對(duì)照。
　　(2)生化檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬

6、化小鼠血漿中血脂各成分的水平:收集8周、16周及24周的ApoE-/-小鼠，并以同年齡同樣處理的C57BL/6小鼠作為對(duì)照，檢測(cè)血漿中總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三脂(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(High density lipoproteins，HDL)的水平來跟蹤疾病的發(fā)展過程。
　　(3)病理學(xué)檢測(cè)動(dòng)脈粥

7、樣硬化斑塊的形成過程:左側(cè)頸動(dòng)脈斑塊制備連續(xù)石蠟切片，以蘇木精-伊紅染色觀察血管的形態(tài)學(xué)特征。
　　(4)通過第一部分所建立的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，使用不同濃度的可溶性環(huán)氧酶抑制劑AUDA從10周開始對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行治療，在第18周時(shí)分離各組小鼠的血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)檢測(cè)血漿中的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TN

8、F-α)、白介素6(Interleukin6，IL6)、金屬基質(zhì)蛋白酶2(Metal matrix proteinase-2，MMP-2)、金屬基質(zhì)蛋白酶9（Metal matrix proteinase-9，MMP-9）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transform growth factorβ，TGF-β)、血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(vas

9、cular celladhesion molecule1，VCAM-1)、細(xì)胞間粘附分子(intercellular cell adhesionmolecule-1，ICAM-1)、血漿和血小板P選擇素(P-selectin)的水平的變化，并確定可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA的優(yōu)化治療濃度。
　　(5)采用優(yōu)化濃度的AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠進(jìn)行治療，通過體重測(cè)量和血脂生化指標(biāo)的分析評(píng)價(jià)AUDA的治療效應(yīng);同時(shí)通過病理學(xué)檢測(cè)動(dòng)

10、脈粥樣硬化斑塊的大小及占血管管腔的面積百分比。
　　2.探討可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制:
　　(1)從10周開始，采用優(yōu)化濃度的AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型進(jìn)行治療，連續(xù)治療8周后，收集獲得血管，通過血管切片和免疫組化分析，評(píng)估單核巨噬細(xì)胞的浸潤和血管平滑肌細(xì)胞的含量。
　　(2)收集血管，抽提獲得血管蛋白，通過免疫印跡法，檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈壁Toll樣受體4(Toll like recep

11、tor4，TLR4)和核因子κB(Nuclear factorκb，NF-κb)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的療效分析:
　　(1)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的評(píng)價(jià):
　　ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血脂水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與同齡的C57BL/6小鼠相比，ApoE-/-小鼠的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和在低密度脂蛋白(LDL)在第8周(

12、p＜0.05)、16周(p＜0.05)和24周(p＜0.05)時(shí)均有顯著升高。
　　同時(shí)，蘇木素伊紅染色的結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠8周時(shí)，血管壁僅出現(xiàn)內(nèi)膜略微增厚，且沒有明顯的斑塊形成。在進(jìn)行縮窄術(shù)并對(duì)小鼠進(jìn)行高脂喂養(yǎng)到16周時(shí)，血管內(nèi)膜有明顯的增厚，平滑肌增生形成較厚的纖維帽。當(dāng)小鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)到24周時(shí)，血管的狹窄程度顯著增加，纖維帽明顯變薄，斑塊表面僅有很薄的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，平滑肌細(xì)胞減少，斑塊內(nèi)呈現(xiàn)多個(gè)空泡樣的結(jié)構(gòu)即壞死

13、核。而同齡的C57BL/6小鼠在任一時(shí)間點(diǎn)均無明顯的斑塊形成。這些結(jié)果表明動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型建立成功。
　　(2) AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠炎癥因子、粘附分子和細(xì)胞外基質(zhì)分子水平的影響，及其治療濃度的優(yōu)化:
　　不同濃度AUDA灌注治療ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠發(fā)現(xiàn)，0.35 mg/kg和0.45mg/kg的AUDA均能夠顯著降低ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血漿炎癥因子（TNF-α、IL6和TGF-β)、粘附分子（

14、VCAM-1、ICAM-1和p-selectin）和細(xì)胞外基質(zhì)分子（MMP2和MMP9）的水平。且0.35 mg/kg的AUDA治療后，這些因子的表達(dá)水平已恢復(fù)至與C57BL/6陰性對(duì)照小鼠相當(dāng)?shù)乃?。因此，確立0.35 mg/kg為優(yōu)化的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的治療濃度。
　　(3) AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的療效分析:
　　對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體重和血脂的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過AUDA灌注的小鼠的體重要明顯低于生理鹽水灌注的小鼠。另外，對(duì)

15、血脂各成分檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)及低密度脂蛋白(LDL cholesterol)在經(jīng)過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠中要顯著低于生理鹽水灌注的ApoE-/-小鼠。而高密度脂蛋白(HDL cholesterol)在經(jīng)過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠中仍高于生理鹽水灌注的ApoE-/-小鼠。
　　此外，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血管病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，從主動(dòng)脈的切片中可見經(jīng)過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇動(dòng)脈

16、粥樣硬化面積相比于對(duì)照小鼠有顯著的減少（2.78±0.09 mm2 vs.0.89±0.07 mm2; p＜0.05）。經(jīng)過AUDA灌注的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積占管腔面積的百分比也顯著低于對(duì)照小鼠[(3.5±1.0)％vs.（20.5±0.9)％,p＜0.05]。
　　2.探討可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制:
　　(1)單核巨噬細(xì)胞的浸潤和血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量減少:相比于生理鹽水灌注

17、的對(duì)照小鼠，AUDA均能夠顯著降低ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血管中單核巨噬細(xì)胞的浸潤程度和血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量。
　　(2) TLR4-NF-κb信號(hào)通路的抑制:相比于生理鹽水灌注對(duì)照小鼠，AUDA均能夠顯著降低ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血管TLR4和NF-κB分子的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA能夠控制ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的體重和血脂的增加，降低其斑塊的面積和血管再狹

18、窄的程度，具有顯著的療效。
　　2.可溶性環(huán)氧酶抑制劑AUDA對(duì)ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的治療作用是通過影響炎癥因子、粘附分子和細(xì)胞外基質(zhì)分子的水平;減輕單核巨噬細(xì)胞的浸潤程度和降低血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量;抑制TLR4-NF-κb信號(hào)通路的活化實(shí)現(xiàn)的。
　　3.可溶性環(huán)氧酶抑制劑AUDA具有血管保護(hù)作用，可能可以作為治療的藥物應(yīng)用于臨床實(shí)踐。
　　創(chuàng)新性和意義：
　　本研究主要通過體內(nèi)動(dòng)物模型，對(duì)可溶性環(huán)氧水

19、解酶抑制劑AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用及機(jī)制進(jìn)行了探討，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病具有重要的理論價(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)和意義如下:
　　1.可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療，0.35 mg/kg為優(yōu)化的動(dòng)脈粥樣硬化治療的濃度。為這種新型的治療制劑應(yīng)用于臨床治療動(dòng)脈硬化提供了理論和實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)可溶性環(huán)氧水解酶抑制劑AUDA能夠通過影響炎癥因子、粘附分子和細(xì)胞外基