β-蒎烯對(duì)柑橘意大利青霉抗菌及其機(jī)理研究.pdf

1、本文研究了β-蒎烯對(duì)柑橘意大利青霉的抑菌活性和作用機(jī)制，對(duì)于新型安全、高效的揮發(fā)性柑橘保鮮劑的開發(fā)及富含蒎烯植物精油的資源利用具有重要的理論和實(shí)踐意義。本文以柑橘意大利青霉為病原菌、β-蒎烯為抗菌劑，評(píng)價(jià)了β-蒎烯對(duì)意大利青霉的抗菌活性，并系統(tǒng)研究了其可能的抗菌機(jī)理，結(jié)果如下：
　　在抑菌活性方面，通過孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)、菌餅實(shí)驗(yàn)和分生孢子計(jì)數(shù)，確定β-蒎烯對(duì)意大利青霉孢子萌發(fā)期、菌絲生長期和分生孢子產(chǎn)生期的最小抑菌濃度，分別為1.6u

2、L/mL、2.7uL/mL、4.4uL/mL，說明β-蒎烯對(duì)意大利青霉各個(gè)生長階段均有抑制作用，且β-蒎烯能夠抑制芽管伸長，幼齡菌絲或孢子對(duì)藥物處理更為敏感。液體培養(yǎng)和顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)β-蒎烯能夠破壞意大利青霉菌絲形態(tài)，造成菌絲斷裂、扁平、空泡化加劇。溫州蜜柑接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)了β-蒎烯的抗菌活性和對(duì)柑橘保鮮的應(yīng)用前景。
　　在作用于細(xì)胞壁的抑菌機(jī)理方面，SEM觀察發(fā)現(xiàn)β-蒎烯能夠引起意大利青霉菌絲形態(tài)改變，表現(xiàn)為坍塌、破裂、展平的空菌絲

3、或表面有不規(guī)則凸起。TEM觀察發(fā)現(xiàn)到菌絲細(xì)胞壁離散或加厚，周質(zhì)空間變大，質(zhì)壁分離，細(xì)胞質(zhì)流出等現(xiàn)象。菌絲外AKP含量測定結(jié)果也說明β-蒎烯能夠引起細(xì)胞壁破裂。通過CFW對(duì)細(xì)胞壁幾丁質(zhì)染色，并測定幾丁質(zhì)和葡聚糖的含量，得出β-蒎烯能夠抑制意大利青霉幾丁質(zhì)和葡聚糖的生物合成，并使幾丁質(zhì)在菌絲上的分布發(fā)生變化。
　　在作用于細(xì)胞膜的抑菌機(jī)理方面，采用熒光顯微鏡觀察PI和Evans blue染色并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)β-蒎烯能夠破壞意大利

4、青霉細(xì)胞膜完整性；對(duì)細(xì)胞膜外pH、膜外電導(dǎo)率和膜內(nèi)內(nèi)容物滲出的測定，說明β-蒎烯能夠使細(xì)胞膜質(zhì)子泵崩潰，造成跨膜電動(dòng)勢紊亂，離子和小分子物質(zhì)滲出，這些現(xiàn)象也反映了細(xì)胞膜完整性被破壞。波長掃描法測定細(xì)胞膜麥角固醇含量和磷酸香草醛法測定細(xì)胞膜總脂質(zhì)含量結(jié)果表明，β-蒎烯能夠降低麥角固醇和總脂質(zhì)含量，進(jìn)而破壞膜流動(dòng)性和結(jié)構(gòu)完整性，影響與膜結(jié)合酶的活性以及物質(zhì)運(yùn)輸，β-蒎烯的抗真菌作用位點(diǎn)可能是細(xì)胞膜麥角固醇。
　　在作用于呼吸和活性氧的

5、抑菌機(jī)理方面，氧呼吸儀測定蒎烯暴露下的菌絲呼吸結(jié)果表明，0.23uL/mL的β蒎烯即可有效抑制菌絲呼吸；熒光顯微鏡觀察 Rh123對(duì)線粒體膜電位染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-蒎烯能夠降低 MMP并存在劑量效應(yīng)關(guān)系。DCFH-DA對(duì)ROS染色、NBT對(duì)O2-和DAB對(duì)H2O2的組織定位，以及SOD和CAT活性和MDA含量的測定結(jié)果說明：β-蒎烯能夠促進(jìn)意大利青霉ROS積累，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，膜結(jié)構(gòu)受損。
　　綜上所述，β蒎烯對(duì)意大利青霉各個(gè)生長

6、那個(gè)時(shí)期均具有良好的抑菌活性，其作用機(jī)理可能有三：一是直接作用于細(xì)胞壁，抑制細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和葡聚糖合成，并引起幾丁質(zhì)在菌絲上的分布變化，導(dǎo)致細(xì)胞壁形態(tài)改變甚至裂解，細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)崩潰，最終導(dǎo)致菌絲死亡。二是作用于細(xì)胞膜，造成細(xì)胞膜質(zhì)子泵和跨膜電動(dòng)勢功能紊亂，細(xì)胞質(zhì)中小分子物質(zhì)流出，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性和選擇透過性，并抑制細(xì)胞膜麥角固醇合成，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)空泡化，最終導(dǎo)致菌絲死亡。三是誘導(dǎo)細(xì)胞氧化脅迫，抑制菌絲呼吸，引起線粒體膜電位降低，破壞呼吸