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1、海藻糖因其獨(dú)特的生物學(xué)功能近年來被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞、組織器官、食品、化妝品和藥物制劑、保藏等領(lǐng)域。由麥芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohy-drolase,MTHase)組成的雙酶體系可以將淀粉轉(zhuǎn)化成海藻糖,可望成為工業(yè)生產(chǎn)海藻糖的新途徑。 本文主要構(gòu)建了來源于玫瑰微球菌的
2、MTHase蛋白的pPICZAα重組表達(dá)載體,在巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系中進(jìn)行了分泌表達(dá)研究。 首先根據(jù)TreZ基因序列設(shè)計引物,以玫瑰微球菌基因組為模板,擴(kuò)增得到1.9Kb目的基因片段。與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR及測序驗(yàn)證,序列測定結(jié)果與報道完全一致。 目的片段經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切處理后定向插入pPICZαA質(zhì)粒中,成功構(gòu)建了MTHase的分泌表達(dá)載體pPICZαA
3、-MTH。重組質(zhì)粒經(jīng)線性化分別電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Pichia pastoris GS115及KM71菌株中,通過Zeocin濃度梯度篩選高拷貝重組菌株,最終在1000μg/ml的濃度下得到若干個單菌落。對得到的GS115菌株進(jìn)行表型驗(yàn)證,證明均為Mut+。 通過測定重組GS115(pPICZαA-MTH)及KM71(pPICZαA-MTH)菌株在BMGY培養(yǎng)基中生長曲線,以及BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中總蛋白含量隨時間的變化曲線,確定的最佳轉(zhuǎn)接
4、時間分別為20h和25h,甲醇誘導(dǎo)時間為72h。 SDS-PAGE結(jié)果顯示,經(jīng)0.5%甲醇28℃下誘導(dǎo)72h后,KM71(pPICZαA-MTH)菌株發(fā)酵液樣品約72.5KD處出現(xiàn)明顯條帶,而GS115(PICZAα-MTH)菌株沒有預(yù)期條帶。KM71(pPICZαA-MTH)菌株樣品western blot出現(xiàn)單一條帶,GS115(pPICZαA-MTH)未出現(xiàn)條帶,進(jìn)一步證明MTHase蛋白在KM71菌株中成功表達(dá),而在G
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