紅色亞棲熱菌海藻糖合酶在畢赤酵母中的優(yōu)化表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、海藻糖因具有眾多獨(dú)特的生理功能而被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、化妝品產(chǎn)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域中。海藻糖合酶能夠通過一步反應(yīng)直接催化麥芽糖生成海藻糖，產(chǎn)物組成較簡(jiǎn)單，不消耗高能物質(zhì)，原料廉價(jià)易得，是工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的好方法。來源于嗜熱菌的海藻糖合酶具有很好的耐熱性，可在較高溫度下反應(yīng)，能夠有效避免工業(yè)生產(chǎn)過程中的的污染問題，因而備受關(guān)注。隨著海藻糖應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，獲得一株穩(wěn)定的、表達(dá)量高的、適合工業(yè)生產(chǎn)的海藻糖合酶工程菌株成為目前亟待解決

2、的問題。許多來源于真菌、細(xì)菌及動(dòng)植物的海藻糖合酶基因已經(jīng)克隆得到，并且大部分已在大腸桿菌中成功表達(dá)，但目前很少有在酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)海藻糖合酶的研究報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中克隆得到了來自紅色亞棲熱菌(Meiothermus ruber)CBS-01中的海藻糖合酶基因，并已在大腸桿菌中得到異源表達(dá)，該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，且具有較好的溫度耐受性，有一定的開發(fā)潛力。但由于原核表達(dá)體系具有易形成包涵體，產(chǎn)酶量較低，

3、在發(fā)酵生產(chǎn)中易丟失表達(dá)質(zhì)粒等缺陷，不利于該酶的工業(yè)化生產(chǎn)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是二十世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種新型的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，它具有研究背景成熟，表達(dá)框穩(wěn)定、操作技術(shù)簡(jiǎn)單、表達(dá)量高、可高密度發(fā)酵生產(chǎn)等優(yōu)越性，迅速成為目前應(yīng)用最為廣泛、極具發(fā)展前景的表達(dá)系統(tǒng)之一。鑒于此，本研究構(gòu)建了海藻糖合酶的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，并通過對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使紅色亞棲熱菌海藻糖合酶在畢赤酵母中的表達(dá)量達(dá)到150mg/L，是在大腸桿菌中表達(dá)量的30

4、倍，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合酶奠定了良好的實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。
　　 利用Ni-NTA親和層析和陰離子交換色譜法對(duì)海藻糖合酶進(jìn)行了分離純化，獲得了純度很高的蛋白酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了較詳細(xì)的檢測(cè)。結(jié)果表明，該酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適作用pH為6.5，并且對(duì)溫度和pH都具有很好的耐受性，在4℃-60℃以及pH5-pH8范圍內(nèi)耐受60min都能夠保留90％以上的活性。此外，4℃冷藏保存2個(gè)月對(duì)該酶的活性幾乎不產(chǎn)生影響，說明該酶非常適