擬南芥幼苗對玻璃化法超低溫保存的逆境響應(yīng)機(jī)制.pdf

1、玻璃化法超低溫保存（Vitrification）是將材料置于玻璃化溶液（Plant Vitrification Solution，PVS）中，使其在快速冷凍過程被固化成玻璃態(tài)，并以這種狀態(tài)在超低溫下保存，是植物種質(zhì)資源中長期保存的首選方法。玻璃化法超低溫保存中的逆境脅迫是造成保存材料致死的主要原因，通過外源物質(zhì)輔助PVS來抑制脅迫損傷是常用的提高凍后成活率的方法。因此，超低溫保存過程中的代謝活動(dòng)、脅迫響應(yīng)以及外源物質(zhì)調(diào)控機(jī)制研究對超低溫

2、保存有著重要的意義。本論文以擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗為研究對象，對比研究不同苗齡幼苗超低溫保存過程中的代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)變化以及基因差異表達(dá)情況，以探討不同苗齡幼苗對超低溫保存的脅迫響應(yīng)差異；同時(shí)適量添加外源物質(zhì)以優(yōu)化超低溫保存體系，并在生理和轉(zhuǎn)錄層面研究外源物質(zhì)對玻璃化法超低溫保存的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步豐富超低溫保存的逆境分子生物學(xué)理論，從而為其它植物超低溫保存技術(shù)體系的建立及優(yōu)化提供理論依據(jù)。
　　1）在擬

3、南芥幼苗玻璃化法超低溫保存研究中發(fā)現(xiàn)，幼苗苗齡與超低溫保存恢復(fù)生長率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，關(guān)系曲線與Logistic方程的擬合度較高，并且曲線的拐點(diǎn)苗齡為58.74 h。細(xì)胞活性原位檢測發(fā)現(xiàn)恢復(fù)生長率為96.8％的48 h幼苗在超低溫保存過程中保持著較為完整的膜結(jié)構(gòu)和較高的細(xì)胞活性，并且可以較快地從超低溫保存損傷中恢復(fù)；而保存后近乎全部死亡的72 h幼苗細(xì)胞活性則較低，并且在恢復(fù)培養(yǎng)階段損傷程度沒有改善，根部的成熟區(qū)和伸長區(qū)仍遭受著嚴(yán)重的膜

4、損傷。
　　2）在不同苗齡幼苗超低溫保存生理生化研究中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源物質(zhì)在超低溫保存過程中存在差異響應(yīng)。72 h幼苗在滲透保護(hù)和脫水（滲透–脫水）過程中活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）水平明顯升高，尤其是產(chǎn)生羥自由基能力增加了1.62倍，同時(shí)膜脂過氧化終產(chǎn)物丙二醛含量增加到近2倍，72 h幼苗經(jīng)受著較為嚴(yán)重的氧化脅迫損傷，相關(guān)性分析表明丙二醛含量與恢復(fù)生長率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，氧化脅迫可能是導(dǎo)致超低溫保存

5、失敗的原因之一。2種苗齡幼苗大部分可溶性糖組分的含量在滲透–脫水后有所增加，且48 h幼苗增量大于72 h幼苗。具有生物活性的順式脫落酸在2種苗齡幼苗處理過程中含量變化幅度很小，但48 h幼苗的脫落酸含量始終高于72 h幼苗；生長素含量在48 h幼苗中上升了近1倍，而72 h幼苗則沒有顯著變化。內(nèi)源激素原位檢測發(fā)現(xiàn)，脫落酸信號在處理過程中沒有明顯增強(qiáng)，一直處于較低水平；而生長素信號在48 h幼苗滲透–脫水過程中則顯著增強(qiáng)，并主要分布在子

6、葉、根部的成熟區(qū)和伸長區(qū)。在滲透–脫水過程中，72 h幼苗嚴(yán)重的膜脂過氧化，以及生長素、可溶性糖等內(nèi)源物質(zhì)對48 h幼苗提供更多的保護(hù)來抵御氧化脅迫，都可能是導(dǎo)致兩種苗齡幼苗恢復(fù)生長率差異的原因。
　　3）為了進(jìn)一步分析苗齡與恢復(fù)生長率呈顯著負(fù)相關(guān)的原因，利用cDNA-AFLP技術(shù)對比研究了48 h和72 h幼苗經(jīng)過滲透–脫水后基因差異表達(dá)情況。64對引物組合分離得到的145條EST序列作為首批植物超低溫保存相關(guān)序列已提交GenB

7、ank數(shù)據(jù)庫。48 h幼苗滲透–脫水前后比較轉(zhuǎn)錄分析表明，53%的差異表達(dá)基因包含在脅迫響應(yīng)、蛋白合成與代謝、代謝與能量中；而72 h幼苗中差異表達(dá)基因則主要包含在運(yùn)輸、信號、細(xì)胞組織和生物合成中，說明超低溫保存過程中不同苗齡幼苗在轉(zhuǎn)錄層面的響應(yīng)存在明顯差異。挑選出54個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)定量分析，并根據(jù)基因表達(dá)模式進(jìn)行了聚類分析，共聚為5類。在差異表達(dá)基因中，脅迫響應(yīng)基因尤其是氧化脅迫響應(yīng)相關(guān)基因在滲透–脫水過程中發(fā)揮了重要的作用，進(jìn)一步證

8、明了氧化脅迫是導(dǎo)致材料死亡的重要原因，并且由于膜脂過氧化造成的質(zhì)膜損傷，使得光合和氧化磷酸化相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)。此外，通過細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因（DAD1）的差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，72 h幼苗在滲透–脫水過程中發(fā)生了細(xì)胞凋亡，而48 h幼苗則有效地抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。2種苗齡幼苗在超低溫保存過程中均經(jīng)受著氧化脅迫，48 h幼苗可以有效地抵御氧化脅迫并保持較高的恢復(fù)生長率。
　　4）外源添加物質(zhì)對于降低超低溫保存過程中的脅迫損傷有著重要的作用

9、。接近苗齡與恢復(fù)生長率關(guān)系曲線拐點(diǎn)的60 h幼苗是篩選有效外源物質(zhì)并研究其調(diào)控機(jī)理的重要材料。分別在60 h幼苗超低溫保存PVS2中添加9種外源物質(zhì)，其中優(yōu)化效果最好的抗氧化劑維生素C（VC）可提高恢復(fù)生長率近2倍。通過60 h幼苗非優(yōu)化和VC優(yōu)化的超低溫保存體系抗氧化生理分析發(fā)現(xiàn)，H2O2是導(dǎo)致超低溫保存氧化傷害的主要ROS組分，并分布在子葉、莖尖以及根部的成熟區(qū)和伸長區(qū)。在非優(yōu)化超低溫保存過程中，ROS水平持續(xù)升高并于解凍后達(dá)到最大

10、值，大量的 ROS激發(fā)了幼苗抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)，內(nèi)源 VC含量和過氧化氫酶活性也隨之升高，同樣在解凍后達(dá)到峰值，但由于氧化脅迫過于嚴(yán)重，內(nèi)源抗氧化劑的響應(yīng)沒能有效地降低膜脂過氧化程度，丙二醛含量亦在解凍后達(dá)到了最大值，標(biāo)志著生物質(zhì)膜嚴(yán)重受損，并導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡。而添加外源VC的脫水過程則提高了內(nèi)源VC含量和過氧化物酶活性，使幼苗在投入液氮前保持著較高的抗氧化水平和較低的氧化損傷程度，最終使優(yōu)化體系的幼苗在凍融、洗滌和恢復(fù)培養(yǎng)階段一直保持著

11、低于非優(yōu)化體系的ROS水平和膜脂過氧化程度，這也造成了兩個(gè)超低溫保存體系恢復(fù)生長率的差異。
　　5）利用擬南芥表達(dá)譜芯片進(jìn)行60 h幼苗非優(yōu)化和VC優(yōu)化的超低溫保存體系比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可以深入地研究外源物質(zhì)的分子調(diào)控機(jī)理。韋恩分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)化脫水過程的特有差異表達(dá)基因是非優(yōu)化體系的近10倍，但優(yōu)化的凍融和洗滌過程特有差異表達(dá)基因數(shù)量僅為非優(yōu)化體系的42%。超低溫保存體系通路富集分析表明細(xì)胞壁和脂類代謝參與了滲透保護(hù)過程，而其它代謝響應(yīng)

12、則相對較弱。在非優(yōu)化超低溫保存脫水過程中，苯丙素類及萜類化合物代謝有所提高，氨基酸合成與代謝明顯下調(diào)。凍融過程使次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸代謝、脂類物質(zhì)代謝和能量代謝等下調(diào)。在洗滌過程中，多種代謝過程繼續(xù)下調(diào)，其中包括光合作用和生物異源物質(zhì)代謝，但非生物脅迫響應(yīng)在洗滌階段則沒有顯著差異表達(dá)。在恢復(fù)培養(yǎng)24 h過程中，部分代謝和調(diào)控相關(guān)基因以上調(diào)表達(dá)為主，但光合仍小幅下調(diào)。碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝均參與到恢復(fù)培養(yǎng)初期的代謝

13、響應(yīng)中。在優(yōu)化超低溫保存脫水過程中，細(xì)胞壁、脂類、光合和次生代謝相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)。優(yōu)化體系恢復(fù)培養(yǎng)初期與非優(yōu)化體系不同的是，更多的代謝和調(diào)控過程出現(xiàn)了減弱的情況，降低了擬南芥幼苗凍后恢復(fù)生長的代謝活動(dòng)，有利于幼苗盡快修復(fù)損傷并調(diào)整正常代謝過程。
　　6）在超低溫保存非生物脅迫信號的感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，作為重要的脅迫信號感知蛋白激酶的組氨酸激酶在非優(yōu)化體系滲透保護(hù)、脫水和凍融過程上調(diào)表達(dá)，而在優(yōu)化體系的滲透保護(hù)和脫水階段上調(diào)表達(dá)。促分

14、裂原活化蛋白激酶（MAPK）中參與滲透保護(hù)脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的為MAPK11，另有MAPK20參與到凍融過程，優(yōu)化的脫水過程中MAPKKK13特異性參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩個(gè)體系的恢復(fù)培養(yǎng)初期均有大量的MAPKs參與并以上調(diào)表達(dá)為主。CBF2在兩個(gè)體系中均于脫水后達(dá)到峰值，其它DREBs在非優(yōu)化體系中雖呈整體上調(diào)表達(dá)趨勢，但特異性地在脫水后出現(xiàn)最低值，而優(yōu)化體系中DREBs則持續(xù)上調(diào)表達(dá)。因此，優(yōu)化體系中的非生物脅迫響應(yīng)比非優(yōu)化體系更為積極，尤其是脫

15、水階段的脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)較強(qiáng)，這也使幼苗更好地適應(yīng)了復(fù)合脅迫環(huán)境，有利于應(yīng)對之后的冷凍等一系列脅迫處理。
　　外源VC對超低溫保存過程中ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亦存在重要的調(diào)控作用。ROS首先通過受體蛋白啟動(dòng)下游鈣離子信號。非優(yōu)化體系中鈣依賴信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子以下調(diào)表達(dá)為主，而優(yōu)化體系中的鈣結(jié)合蛋白則以上調(diào)為主。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在 ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到核心作用，它在非優(yōu)化體系洗滌階段下調(diào)表達(dá)，但在優(yōu)化體系中則持續(xù)上調(diào)表達(dá)。一些重要的 ROS調(diào)控