瑞士乳桿菌MB2-1胞外多糖制備、結構和生理功能的研究.pdf

1、乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)由于其優(yōu)良的物化特性和生理活性已成為廣大研究者廣泛研究的熱點。乳酸菌EPS是指乳酸菌在其生長代謝過程中產生的代謝產物，它包括依附在細胞壁上的莢膜多糖和分泌到細胞外的粘液多糖。據(jù)報道，EPS不僅具有改善發(fā)酵乳制品口感、組織狀態(tài)和流變性的效果，還能作為穩(wěn)定劑、乳化劑、增稠劑等食品添加劑的替代品，不僅如此，許多乳酸菌EPS已被證實具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗炎癥以及降低膽固醇等生

2、理活性。
　　本論文以從新疆賽里木酸奶中篩選到的一株具有產EPS的瑞士乳桿菌MB2-1為研究對象，對其EPS的分離純化、結構特征和生理功能等進行了系統(tǒng)的研究。
　　1、采用8％(W/V)乳清粉培養(yǎng)基于50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)（溫度42℃，接種量4％，發(fā)酵時間32 h)，發(fā)酵液經(jīng)過離心除菌體收集上清液，然后用終濃度為4％(W/V)的三氯乙酸(TCA)去除上清液中的蛋白質，離心收集上清液并減壓濃縮，用3倍體積的無水乙醇沉淀得到粗

3、多糖，得率為789 mg/L。
　　2、獲得的粗多糖依次利用DEAE-52陰離子交換柱和Sephadex G-100凝膠柱進行分離純化，可以得到三個純組分，分別命名為LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3。根據(jù)對比DEAE-52柱層析前的粗多糖質量和凝膠柱G-100純化后的多糖組分的含量，可得到LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的得率分別為10.47、46.96和2.81％，總回收率為60.24％。在高效液相色

4、譜上，LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3均顯示單一對稱的色譜峰，分子量分別為2.08×105、2.04×105和2.01×105Da。分別采用考馬斯亮藍法、硫酸-苯酚法、間羥基聯(lián)苯比色法和氯化鋇-明膠比濁法，測定粗多糖和三個多糖純組分中蛋白質、總糖、糖醛酸和硫酸基的含量，結果表明，粗多糖、LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的蛋白質含量分別為4.08％、未檢出、未檢出和0.29％;中性糖含量分別為71.68、97.

5、85、94.54和67.62％;糖醛酸含量分別為2.98、0.53、1.96和2.53％;硫酸基含量分別為1.43、0.27、0.42和0.87％。
　　3、通過多種方法進行了LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的結構鑒定。多糖的紫外全波長掃描結果顯示LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3在190～500nm的波長范圍內無核酸和蛋白質的吸收峰，其中LHEPS-3含有微量的蛋白質。單糖組成的分析結果表明LHEPS-

6、1、LHEPS-2和LHEPS-3均是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其各自單糖組成的摩爾比為1∶2.75∶1.33，9.34∶1.43∶1和2.96∶1∶1.17。LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3紅外光譜分析的結果表明，三者都具有多糖的特征吸收峰，均含有吡喃糖苷;LHEPS-1含有β-D-Glc和α-D-Man，LHEPS-2和LHEPS-3的紅外光譜圖基本相似，但單糖組成的比例不同;此外，LHEPS-3中含有N-H的彎曲

7、振動峰，說明LHEPS-3中含有少量的蛋白質。甲基化反應和氣質聯(lián)用分析的結果說明，LHEPS-1的主鏈上存在→4，6-D-Manp-(1→和→3，6-D-Glcp-(1→，且有兩個分支結構，存在于甘露糖殘基上和葡萄糖殘基鏈上，分支結構的末端為D-Glcp和D-Galp; LHEPS-2糖鏈的骨架主要由→4-D-Manp-(1→和→6-D-Manp-（1→組成，另外→4-D-Galp-（1→和→6-D-Glcp-(1→可能存在于骨架鏈上或

8、分支結構上;分支結構上的分支點在甘露糖殘基鏈上，且分支結構的末端為D-Glcp; LHEPS-3糖鏈的骨架存在→4，6-D-Manp-(1→和→3，6-D-Manp-(1→，并且各自含有一個分支結構，分支結構的末端為D-Glcp和D-Galp。將1DNMR和2D NMR的結果與上述分析結果相結合，可推測出LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的結構如下:
　　LHEPS-1:α-D-Glc-(1→3)-α-D-Glc-(1

9、→6)-α-D-Glc1↓6β-D-Gal-(1→2)-β-D-Glc1↓6[→4)-α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→]n
　　LHEPS-2:α-D-Glc-(1→4)-α-D-Man-(1→6）-α-D-Glc1↓6[→4）-α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-α-(1→4)-α-D-Gal-(1→] n
　　L

10、HEPS-3:β-D-Gal-（1→3)-α-D-Man-(1→2）-β-D-Man1↓6[→4)-α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-(1→3）-β-D-Man-(1→4）-α-D-Gal-(1→] n6↑1α-D-Glc-(1→4)-α-D-Man-(1→6)-α-D-Glc
　　掃描電鏡結果顯示，LHEPS-1的表面光滑，成碎片狀的聚集態(tài)，LHEPS-2和LHEPS-3為管狀的聚集態(tài)，彼此堆積呈發(fā)射狀且內部中空。三種

11、多糖組分的原子力顯微鏡的結果表明，多糖表面形成道釘狀的突起，大小不一，小的高度為2nm，大的高度可達380 nm。
　　4、體外抗氧化能力的實驗結果表明，胞外多糖具有較強的超氧陰離子自由基清除活性，中等的羥基自由基清除活性和金屬離子螯合能力，較弱的DPPH自由基清除活性。多糖樣品體外抗氧化能力的順序依次為粗多糖＞ LHEPS-3＞LHEPS-2＞LHEPS-1，其中超氧陰離子自由基清除能力的順序為粗多糖＞LHEPS-2＞LHEPS

12、-3＞LHEPS-1。
　　5、利用體外腫瘤細胞模型進行研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacilus helveticus MB2-1 EPS對人肝癌細胞HepG-2、人胃癌細胞BGC-823和人結腸癌細胞Caco-2的生長均有一定的抑制作用，其中對HepG-2細胞的增殖抑制作用最強，BGC-823次之，Caco-2最弱，所以本課題對HepG-2細胞進行深入研究。后續(xù)實驗結果表明，EPS作用HepG-2細胞后，細胞內的乳酸脫氫酶活力隨著多糖