不同發(fā)芽條件下鷹嘴豆異黃酮變化及對3T3-L1脂肪細(xì)胞分化影響.pdf

1、目的：本文通過不同的發(fā)芽條件篩選出鷹嘴豆最佳發(fā)芽條件，并且探討了篩選出的鷹嘴豆芽和鷹嘴豆種子異黃酮對3T3-L1前體細(xì)胞分化的影響及其可能作用機(jī)制，為接下來研究鷹嘴豆的保健應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
　　方法：(1)將鷹嘴豆進(jìn)行黑暗發(fā)芽，光照發(fā)芽，酒精脅迫發(fā)芽，鹽脅迫發(fā)芽，并且分別取第二天，第四天，第六天，第八天，第十天和第十二天的鷹嘴豆芽和種子，提取異黃酮，進(jìn)行UHPLC-MS檢測，研究四種發(fā)芽方式的鷹嘴豆芽及種子中異黃酮種類及含量的

2、變化，并篩選出鷹嘴豆最佳發(fā)芽條件。(2)將篩選出的鷹嘴豆芽和鷹嘴豆種子中提取的異黃酮純化后由MTT實驗檢測不同濃度樣品的細(xì)胞毒性，挑選合適濃度對脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅染色處理，并進(jìn)行甘油三酯的檢測，觀察脂肪堆積狀況，研究篩選出的鷹嘴豆芽與鷹嘴豆種子異黃酮對3T3-L1前體細(xì)胞分化的影響。(3)提取分化后脂肪細(xì)胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)，通過RT-PCR和Western-blot檢測轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPα的表達(dá)及脂肪細(xì)胞分化后期標(biāo)志性蛋白LP

3、L、ap2、GULT4，探討鷹嘴豆影響3T3-L1前體細(xì)胞分化的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：(1)四種發(fā)芽方式處理后的鷹嘴豆芽異黃酮含量顯著提高，同時經(jīng)過發(fā)芽，鷹嘴豆中染料木素含量降低，并有新的異黃酮成分（芒柄花苷、野靛黃素和乙?；咸屈S豆黃素）產(chǎn)生。在異黃酮種類一致的前提下，光照發(fā)芽處理鷹嘴豆芽異黃酮增加量最多，在第8天異黃酮總含量為種子的135倍，其中主要異黃酮：鷹嘴豆芽素A(biochanin A)含量增加了130倍，芒柄花黃素(

4、formononetin)含量增加了154倍。因此我們選取光照處理組為最有效的發(fā)芽處理方法來進(jìn)行后續(xù)實驗。(2)首先將光照發(fā)芽的鷹嘴豆芽和鷹嘴豆種子提取出的異黃酮進(jìn)行純化，純化后的鷹嘴豆芽異黃酮標(biāo)記為 IGL，鷹嘴豆種子異黃酮標(biāo)記為ICS。MTT細(xì)胞毒性實驗表明50μg/mL和100μg/mL的IGL和ICS對細(xì)胞沒有毒性。油紅O染色和甘油三酯含量測定的結(jié)果表明IGL和ICS樣品都能夠抑制細(xì)胞的分化并且在抑制細(xì)胞分化的效果上呈現(xiàn)劑量依賴

5、性，其中IGL在100μg/mL時抑制作用最明顯。(3) PPARγ及其相關(guān)因子的mRNA表達(dá)結(jié)果及蛋白印跡結(jié)果表明鷹嘴豆光照發(fā)芽后提取出的異黃酮通過調(diào)控PPARγ通路來對脂肪細(xì)胞的分化產(chǎn)生抑制，并且鷹嘴豆異黃酮在濃度為50μg/mL到100μg/mL之間，抑制分化的效果是遞增的。
　　結(jié)論：(1)黑暗發(fā)芽，光照發(fā)芽，酒精脅迫發(fā)芽，鹽脅迫發(fā)芽四種發(fā)芽處理方式，光照發(fā)芽為最佳發(fā)芽條件。(2)光照發(fā)芽的鷹嘴豆芽和鷹嘴豆種子提取出的異黃