恰塔努加鏈霉菌納他霉素高效生物合成的分子機(jī)制.pdf

1、納他霉素是一類多烯類抗生素，在食品和醫(yī)療上被廣泛用作抗真菌劑，由于工業(yè)菌發(fā)酵水平較低，限制其廣泛應(yīng)用。納他霉素合成過程為典型的I型PKS途徑，但其系列合成反應(yīng)如何高效鏈接、形態(tài)分化與合成途徑如何協(xié)同等機(jī)制至今未有清晰解析，本研究以納他霉素工業(yè)菌株恰塔努加鏈霉菌L10為研究對象，對其高效生物合成的分子機(jī)制進(jìn)行較為深入的研究，同時(shí)為工業(yè)菌高產(chǎn)改造提供了理論依據(jù)。
　　首先解析了納他霉素合成途徑的后修飾機(jī)制。通過對其中5個后修飾酶編碼基

2、因進(jìn)行遺傳改造，獲得了4，5-脫環(huán)氧脫糖納他霉素、4，5-脫環(huán)氧納他霉素、4，5-脫環(huán)氧-12-脫羧基-12-甲基納他霉素及其脫水化合物等納他霉素類似物，其中后2個為新化合物。生物指示試驗(yàn)結(jié)果顯示，其中后3個類似物具有一定的抗真菌活性。scnD的缺失株不產(chǎn)生納他霉素但積累高產(chǎn)量的4，5-脫環(huán)氧納他霉素，scnK、scnJ和scnC的缺失株均不產(chǎn)生納他霉素而累積大量的4，5-脫環(huán)氧脫糖納他霉素。scnG的缺失株也不產(chǎn)納他霉素，而產(chǎn)生4，5

3、-脫環(huán)氧-12-脫羧基-12-甲基納他霉素及其脫水化合物。此外，scnG相連的scnF缺失株中納他霉素產(chǎn)量降低了53％，同源糖基轉(zhuǎn)移酶基因amphDI和nysDI可以部分回補(bǔ)scnK的功能。研究結(jié)果表明，納他霉素合成過程中ScnG、ScnK和ScnD依次催化羧基化、糖基化和環(huán)氧化修飾，后修飾機(jī)理的揭示進(jìn)一步充實(shí)了納他霉素生物合成途徑機(jī)制。
　　微生物本身的生物經(jīng)濟(jì)學(xué)原理總是限制每種次級代謝產(chǎn)物的過度合成，特別是野生菌的PKS途徑自

4、然設(shè)立了許多限速步驟。因此揭示合成途徑限速步反應(yīng)，改造關(guān)鍵合成元件的適配性，是建立高速生物合成途徑的關(guān)鍵。本研究成功建立了鏈霉菌梯度誘導(dǎo)表達(dá)體系，用于鑒定納他霉素合成途徑中潛在的限速步驟。以誘導(dǎo)型啟動子OROlac和強(qiáng)啟動子ermEp*為基礎(chǔ)，在沒有誘導(dǎo)劑的條件下，OROlac的表達(dá)受到LacI蛋白的阻遏;當(dāng)加入誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)，LacI對OROlac阻遏得到解除。利用這一模型，首先在鏈霉菌L10中導(dǎo)入抑制型的egfp質(zhì)粒，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)

5、，Western blotting和qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示其表達(dá)量隨著IPTG的升高逐漸升高直至最大值，且在相對較寬的誘導(dǎo)濃度范圍內(nèi)保持一定的誘導(dǎo)表達(dá)量。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一系列scnK、scnJ、scnC和scnD的回補(bǔ)菌株，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析顯示，納他霉素的產(chǎn)量隨著它們的表達(dá)量的升高而升高，從而揭示了納他霉素合成途徑中糖基化和環(huán)氧化修飾步驟是限速步驟，其對應(yīng)的催化酶是限速酶，且在我們體內(nèi)穩(wěn)態(tài)動力學(xué)分析范圍內(nèi)這些酶的催化活性并未出現(xiàn)飽

6、和狀態(tài)和抑制現(xiàn)象。
　　針對上述限速反應(yīng)節(jié)點(diǎn)及其對應(yīng)的關(guān)鍵酶的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)曲線，采用鏈霉菌常用的強(qiáng)表達(dá)啟動子ermEp*，在L10中分別高表達(dá)scnK、scnD、scnJ和scnC基因，納他霉素的產(chǎn)量均有顯著的提高，而且其累積的中間代謝產(chǎn)物大幅降低。組合高表達(dá)scnKJC和scnKJCD后，納他霉素產(chǎn)量進(jìn)一步提高，兩者累積的中間代謝產(chǎn)物均顯著下降，獲得的高產(chǎn)菌株在YEME中納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高了147％，在工業(yè)培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)量提高了

7、232％。50 L發(fā)酵罐小試中，以還原糖濃度≈2％、溶氧≥30％、pH6.3作為發(fā)酵工藝放大的關(guān)鍵參數(shù)，發(fā)酵164 h時(shí)，最高產(chǎn)量達(dá)到15.7 g/L。因此通過增強(qiáng)限速步驟中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，減少中間代謝產(chǎn)物的累積，消除限速步驟，是建立微生物藥物高速生物合成通路的關(guān)鍵。
　　微生物藥物生物合成途徑受到調(diào)控網(wǎng)路的復(fù)雜調(diào)控，其中菌體生長量往往和次級代謝產(chǎn)量關(guān)聯(lián)耦合，而sigma因子在轉(zhuǎn)錄水平上對鏈霉菌形態(tài)分化和次級代謝過程起協(xié)同調(diào)控

8、作用，但該機(jī)制未有針對性的闡析。本研究選擇L10中第三類sigma因子WhiGch，對其多效調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。whiGch的缺失株生長變慢導(dǎo)致納他霉素的產(chǎn)生延遲24 h，并且納他霉素產(chǎn)量比出發(fā)菌下降了30％，whiGch高表達(dá)菌在工業(yè)培養(yǎng)基中產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了26％; WhiGch正調(diào)控納他霉素生物合成途徑，同時(shí)抑制migrastatin和jadomycin類似物生物合成基因簇基因表達(dá)。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明WhiGch可直接結(jié)合到納他霉素基