A549細(xì)胞中TrkB激活的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1，探討STAT3活性是否參與A549中TrkB的激活。
　　2，探討B(tài)DNF-TrkB信號(hào)是否影響STAT3活性及下游信號(hào)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理
　　人類的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549用Dulbecco's modified Eagle's培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)加入10％胎牛血清(Invitrogen)和5mM谷氨酰胺，培養(yǎng)在37℃，飽和濕度，5

2、％二氧化碳培養(yǎng)箱中。
　　2.蛋白免疫印跡(WB)
　　通過(guò)免疫印跡測(cè)定目的蛋白質(zhì)的含量。簡(jiǎn)言之，等量的蛋白質(zhì)（10μg/每個(gè)上樣孔）被SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移到0.22um PVDF膜上(Bio-Rad Inc.)。將膜孵育在封閉液中(0.2mM Tris，137mM Nacl，5％脫脂牛奶以及0.1％Tween-20)一個(gè)小時(shí)，然后放在4℃抗體中過(guò)夜。用TBST緩沖液(0.1％ Tween-20，0.2mM Tri

3、s，137mM NaCl)沖洗PVDF膜后，在室溫下孵育HRP-結(jié)合的二抗(1∶5000)一個(gè)小時(shí)，然后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
　　3.實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)
　　腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成是通過(guò)定量RT-PCR來(lái)衡量的。細(xì)胞用PBS沖洗后，提取RNA。根據(jù)操作說(shuō)明用TRNzol-A+RNA提取試劑(TIANGEN)提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄1μg的總RNA和RevertAid First Strand cDNA Synthesis試

4、劑盒(Fermentas)。實(shí)時(shí)定量PCR使用SYBR GREEN(Roche)進(jìn)行(MyiQ2Bio-Rad)檢測(cè)。用2-△△CT方法將每個(gè)孔的BDNFmRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析
　　顯著性差異統(tǒng)計(jì)使用T檢驗(yàn)和方差分析（方差分析）方法。數(shù)據(jù)顯示用mean±SEM表示，p＜0.05被認(rèn)為是有顯著變化的。所有的實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三次。
　　結(jié)果：
　　1.TrkB在人類肺癌細(xì)胞株A549中表達(dá)

5、，并存在組成型激活
　　為了檢測(cè)TrkB的表達(dá)和激活，本實(shí)驗(yàn)用免疫印跡分析(WB)檢測(cè)不同條件下A549細(xì)胞裂解液。分別用pan-TrkB抗體檢測(cè)TrkB蛋白表達(dá)，用phospho-Trk抗體檢測(cè)激活的TrkB。在肺癌細(xì)胞中加入BDNF刺激1h作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，TrkB在A549細(xì)胞中存在表達(dá)和組成型激活。在A549細(xì)胞中，只有145kD的TrkB-FL亞型的表達(dá)，沒(méi)有TrkB.T1的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞無(wú)血清饑餓

6、1h后TrkB磷酸化水平顯著降低，而A549細(xì)胞無(wú)血清饑餓24小時(shí)后TrkB的磷酸化水平又恢復(fù)到饑餓前水平。在血清饑餓的條件下TrkB的磷酸化可以自發(fā)恢復(fù)，提示我們可能有配體BDNF自分泌機(jī)制的存在。為了確認(rèn)這種可能性，我們檢測(cè)在A549細(xì)胞中是否存在BDNF的表達(dá)。結(jié)果表明A549存在內(nèi)源性BDNF的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)證明了在A549細(xì)胞中BDNF作為主要因素激活TrkB。
　　2.在A549細(xì)胞中STAT3轉(zhuǎn)錄因子是BDNF表達(dá)的

7、主要影響分子
　　為了研究在無(wú)血清的條件下STAT3是否激活，我們進(jìn)行了免疫印跡分析法測(cè)定STAT3磷酸化水平。在A549細(xì)胞中，存在Stat3酪氨酸磷酸化以及絲氨酸磷酸化，1h的血清饑餓可以降低STAT3的磷酸化，但24h血清饑餓后，STAT3的磷酸化水平與對(duì)照組相比都升高。和Stat3酪氨酸磷酸化相一致的是，特異性的STAT3抑制劑——Sattic預(yù)處理A549，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA和蛋白水平都顯著降低。在無(wú)血清條件下，

8、Star3活性被Sattic抑制能阻斷A549細(xì)胞中BDNF在血清饑餓后的自發(fā)恢復(fù)。結(jié)果提示我們，在A549細(xì)胞中STAT3影響B(tài)DNF的表達(dá)。
　　3.在A549細(xì)胞中BDNF是Stat3活性的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子
　　據(jù)先前的研究報(bào)道，STAT3同時(shí)是BDNF及其受體TrkB的下游信號(hào)目標(biāo)。在A549細(xì)胞中，為了研究STAT3活性是否也受BDNF及其受體TrkB調(diào)節(jié)，在細(xì)胞水平，我們檢測(cè)了存在Trk的抑制劑K252a時(shí)，S

9、TAT3的磷酸化水平。結(jié)果表明，阻斷TrkB活性通路可以顯著減少STAT3的磷酸化水平;而更多的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可能進(jìn)一步激活STAT3。為了檢測(cè)在A549細(xì)胞中無(wú)血清條件下，STAT3活性的恢復(fù)是否依賴BDNF;我們?cè)跓o(wú)血清條件下加入K252a后處理12 h;此時(shí)A549細(xì)胞被檢測(cè)出STAT3的磷酸化水平低于沒(méi)有加入K252a情況。結(jié)果表明，A549細(xì)胞在無(wú)血清條件下阻斷TrkB活性可能放緩STAT3的自發(fā)恢復(fù)。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈提示，在

10、A549細(xì)胞中BDNF增強(qiáng)STAT3活性。
　　4.STAT3誘導(dǎo)的BDNF表達(dá)參與Akt蛋白激酶的激活
　　為了檢驗(yàn)是否STAT3誘導(dǎo)BDNF表達(dá)與TrkB及其下游信號(hào)通路激活有關(guān)，我們檢測(cè)了STAT3抑制劑是否影響AKT的活性。AKT是當(dāng)細(xì)胞暴露于凋亡刺激下，重要的反應(yīng)蛋白之一。我們分別加入K252a和Satic抑制劑處理細(xì)胞，然后我們檢測(cè)Akt蛋白激酶的磷酸化水平。如圖所示，再加入Sattic或K252a處理后，細(xì)胞中

11、Akt磷酸化水平減少。結(jié)果表明，BDNF/TrkB和STAT3活性都與Akt蛋白激酶的激活相關(guān)。更重要的是，外源加入K252a不能進(jìn)一步降低Sattic處理的細(xì)胞中Akt蛋白激酶的磷酸化水平。這些結(jié)果證明了STAT3誘導(dǎo)的BDNF表達(dá)參與Akt蛋白激酶的激活。
　　結(jié)論：
　　肺癌是目前全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。在所有肺癌中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占到80％。而且NSCLC的發(fā)病率幾年來(lái)仍在上升。非小細(xì)胞肺癌往

12、往對(duì)現(xiàn)有化療藥物不敏感，因此進(jìn)一步了解哪些分子參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展調(diào)控，具有重要的價(jià)值。
　　腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素超家族一員，在神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能研究中，都顯示出重要功能。最近，一些研究表明，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體TrkB可能參與一些惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰腺導(dǎo)管癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌和肺癌等。然而目前在非小細(xì)胞肺癌中如何引起TrkB下游信號(hào)激活的分子機(jī)制尚不清楚。
　　本

13、研究以非小細(xì)胞肺癌中常見(jiàn)的細(xì)胞模型——A549細(xì)胞為主要研究材料，研究了非小細(xì)胞肺癌中，BDNF激活及調(diào)控的機(jī)制。本研究主要有以下三個(gè)方面的發(fā)現(xiàn):
　　首先，本研究發(fā)現(xiàn)A549中TrkB的激活可以依賴其自分泌的BDNF實(shí)現(xiàn)，而不是依賴微環(huán)境中旁分泌的BDNF。而且表明這種BDNF的自分泌調(diào)控，依賴STAT3的活性。以往研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌中，存在TrkB表達(dá)的增加，以及外源加入BDNF可以增加TrkB的活性，及影響下游功能，但

14、沒(méi)有研究體內(nèi)情況下，TrkB的激活所需的配體從何而來(lái)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR及WB實(shí)驗(yàn)，證明A549細(xì)胞中，存在BDNF的內(nèi)源性表達(dá)，而且這種內(nèi)源性表達(dá)的BDNF參與了TrkB活性的調(diào)控。研究顯示，A549細(xì)胞內(nèi)，BDNF的調(diào)控受到STAT3的調(diào)控。STAT3在多種腫瘤調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用，并且已經(jīng)被報(bào)道參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。我們的研究顯示，抑制STAT3的活性，可以顯著減少BDNF的合成，提示STAT3是BDNF合成分泌重要的調(diào)控因子

15、。
　　第二，本研究發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB信號(hào)可以進(jìn)一步上調(diào)STAT3的活性，而這種上調(diào)進(jìn)一步增加了BDNF的表達(dá)及分泌，以及TrkB的激活。我們研究發(fā)現(xiàn)，不僅STAT3可以調(diào)控BDNF的合成，BDNF/TrkB活性可以反過(guò)來(lái)調(diào)控STAT3的活性。而這種BDNF引起的STAT3活性上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)了BDNF的合成釋放。這形成了一個(gè)典型的正反饋調(diào)控，可能是導(dǎo)致肺癌細(xì)胞中STAT3及TrkB活性大量增強(qiáng)的原因之一。
　　第三，本

16、研究發(fā)現(xiàn)這種STAT3依賴BDNF分泌的正反饋調(diào)控，影響了A549細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路的激活。結(jié)果顯示，在A549中，阻斷STAT3可以引起AKT磷酸化水平的下降，而這種下降不會(huì)因?yàn)門(mén)rk活性的抑制而更低。提示了STAT3對(duì)于AKT的活性調(diào)控，可能是由于對(duì)BDNF合成的調(diào)控所引起的。也就是說(shuō)，STAT3依賴的BDNF分泌的正反饋調(diào)控，影響了A549細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路的激活。
　　意義:
　　在本研究中，