兩種新型酶聯(lián)免疫分析法超靈敏檢測(cè)單核增生李斯特菌和大腸桿菌O157-H7.pdf

1、分類號(hào)：O657.3密級(jí)：公開UDC：學(xué)號(hào)：407304714055南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文兩種新型酶聯(lián)免疫分析法超靈敏檢測(cè)單核增生李斯兩種新型酶聯(lián)免疫分析法超靈敏檢測(cè)單核增生李斯特菌和大腸桿菌特菌和大腸桿菌O157:H7TwoNovelEnzymelinkedImmunosbentAssayftheUltrasensitiveDetectionofListeriamonocytogenesEscherichiacoliO157:H7

2、陳銳培養(yǎng)單位（院、系）：生命科學(xué)學(xué)院中德聯(lián)合研究院、食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)教師姓名、職稱：熊勇華博士、研究員許恒毅博士、副研究員申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門類：理學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文答辯日期：2017年5月27日答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱人：2017年5月27日摘要II摘要酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（Enzymelinkedimmunosbentassay，ELISA）是基于免疫酶技術(shù)發(fā)展的一種非放射性免疫標(biāo)記分析技術(shù)，其中基于辣根過

3、氧化物酶（Hseradishperoxidase，HRP）催化底物產(chǎn)生顯色信號(hào)的常規(guī)ELISA方法檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，而基于新型信號(hào)輸出的高靈敏ELISA是當(dāng)前分析化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。食源性致病菌是一種以肉制品、蛋制品、水產(chǎn)品、果蔬及乳制品等生鮮食品為傳播媒介，隨食物攝入人體或動(dòng)物消化道后釋放致病因子引起中毒的致病性細(xì)菌。食源性致病菌造成的食品污染問題已成為食品安全的主要問題之一，因食源性致病菌引起的食源性疾病占食品中毒事件的30%－9

4、0%。因此，建立簡(jiǎn)單、快速且靈敏的食源性致病菌特異性檢測(cè)方法對(duì)于控制食源性致病菌污染具有重要意義。本研究探討了基于過氧化氫酶（Catalase，CAT）介導(dǎo)的兩種新型ELISA提高單核增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，L.monocytogenes）和大腸桿菌O157:H7（EscherichiacoliO157:H7，E.coliO157:H7）檢測(cè)靈敏度的可行性及理論依據(jù)。首先研究了基于CAT介導(dǎo)的金納米粒子

5、可控生長(zhǎng)的表面等離子共振ELISA（PlasmonicELISA，pELISA）建立了超靈敏檢測(cè)L.monocytogenes的新方法。該研究以二氧化硅（Silicondioxide，SiO2）納米顆粒為載體，通過可逆加成－斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合方法在SiO2納米顆粒表面修飾聚丙烯酸分子刷（PAA），以此作為CAT的“集裝箱”提高酶的載量，通過生物素（Biotin）－鏈霉親和素（Streptavidin，SA）系統(tǒng)將SiO2@PAA@CA

6、T復(fù)合物引入ELISA。當(dāng)檢測(cè)體系中存在L.monocytogenes時(shí)，雙氧水被消耗，氯金酸被還原形成粒徑不規(guī)則的納米粒子，溶液呈藍(lán)色；當(dāng)檢測(cè)體系中不存在L.monocytogenes時(shí)，足量的雙氧水還原氯金酸形成規(guī)則的球形金納米粒子，溶液呈紅色。依據(jù)該原理，建立了檢測(cè)L.monocytogenes的曲線回歸方程：y=?0.015Log(x)?0.2057（R2=0.985），定量檢測(cè)范圍為8100CFUmL至8106CFUmL。檢測(cè)

7、PBS（0.01M，pH7.4）中L.monocytogenes的最低檢測(cè)限（LOD）為8101CFUmL，較傳統(tǒng)的ELISA提高了5個(gè)數(shù)量級(jí)。當(dāng)L.monocytogenes加標(biāo)濃度分別為8100、8101、8102和8103CFUg時(shí)，該方法的回收率分別為5012.5%、101%22.6%、68.3%6.13%和76.8%21.8%；當(dāng)加標(biāo)濃度為8100CFUg，將1mL稀釋液等分成10等份全部用pELISA檢測(cè)，pELISA的檢測(cè)