單核細(xì)胞增生李斯特氏菌膠體金免疫層析方法的建立.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogens,LM)是一種重要的食源性致病菌,世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列入重點檢測的四大食源性致病菌之一。LM能引起人類和動物李斯特氏菌病。人和動物感染LM可引起單核細(xì)胞增多癥、腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn),嚴(yán)重威脅人類健康和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,同時也造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此,加強(qiáng)食品中LM檢測工作,建立一種快速、簡便的篩查方法具有重要的意義。本研究旨在建立一種簡便的、特異性強(qiáng)的針對食品中LM的

2、膠體金免疫試紙條檢測方法。
　　 本研究分別用0.3％福爾馬林滅活的LM菌體和超聲波破碎的菌體碎片免疫日本大耳白兔制備多克隆抗體。獲得的多克隆抗體效價均達(dá)300000,與金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、福氏志賀氏菌有交叉反應(yīng)。多克隆抗體用辛酸-硫酸銨法和磁珠吸附法純化后純度明顯提高。以酸溶堿沉法提取的LM鞭毛蛋白作為免疫原免疫Balb／c小鼠制備單克隆抗體。通過間接ELISA方法對Balb／c小鼠脾臟細(xì)胞和SP2／0骨髓瘤細(xì)胞的融合

3、細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測,篩選到6株陽性融合細(xì)胞。但6株陽性融合細(xì)胞經(jīng)過第一次亞克隆后轉(zhuǎn)為陰性,最終沒有篩選到能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的融合細(xì)胞株。
　　 本研究用兩株可配對的抗LM單克隆抗體,建立了特異性檢測LM的膠體金免疫層析方法?？筁M單克隆抗體標(biāo)記膠體金顆粒,醋酸纖維素膜上分別包被另一株抗LM單克隆抗體和驢抗鼠二抗作為檢測線和控制線,組裝成膠體金免疫層析試紙條。最終確定的生產(chǎn)工藝參數(shù)為:膠體金顆粒粒徑為40 nm左右,抗LM單

4、克隆抗體A標(biāo)記量為20μg／(mL膠體金溶液),標(biāo)記時pH值為8.1,檢測線上抗LM單克隆抗體B濃度為2.0 mg／mL,控制線上驢抗鼠二抗?jié)舛葹?.0 mg／mL。在此工藝條件下,對LM純培養(yǎng)物的檢測靈敏度為107CFU／mL。對Ⅰ和4b血清型的LM均可檢測,與同屬的綿羊李斯特氏菌及屬外的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌等菌無交叉反應(yīng)。在實際食品樣本添加LM,經(jīng)李氏菌增菌液選擇性增菌48 h后試紙條檢測結(jié)果為陽性,并用OXA平板