磁性微球表面瞬時(shí)衍生化學(xué)發(fā)光新技術(shù)檢測(cè)特定序列DNA的研究.pdf

1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究表明：許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生都與基因的突變有關(guān)，另外許多傳染性疾病足出環(huán)境中的病毒、病菌或寄生蟲所引起，因此對(duì)特定序列DNA的分析以及對(duì)DNA鏈中堿基突變的撿測(cè)存基因篩選、法醫(yī)學(xué)簽定、遺傳疾病的早期診斷和治療、病原基因的測(cè)定方面具有十分深遠(yuǎn)的意義。近年來，快速可靠的特定序列DNA檢測(cè)技術(shù)得以迅速發(fā)展。大量的研究以晦、同位素、熒光、電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光等標(biāo)記物標(biāo)記 DNA探針，建立高靈敏度、高選擇性的特定序列 DNA 的檢

2、測(cè)技術(shù)。鑒于 DNA 探針標(biāo)記物的存在，一定程度上復(fù)雜化了傳感器的制備和使用，所以無標(biāo)記型DNA檢測(cè)技術(shù)的研究成為病原基因測(cè)定和基因疾病診斷領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)之一。 化學(xué)發(fā)光(CL)分析法不需要光源，避免了雜散光的干擾，因此具有極高的靈敏度；且這一方法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，因而得到了迅速發(fā)展。目前，CL 分析成為一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域，已成助地用于藥學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境學(xué)中各種物質(zhì)的檢測(cè)。2003年，本研究小組

3、首次報(bào)道了基于鳥嘌呤特異性化學(xué)發(fā)光的無標(biāo)記 (瞬時(shí)衍生)DNA檢測(cè)新技術(shù)。 本論文旨在發(fā)展了一系列具有創(chuàng)新意義的磁性微球表面瞬時(shí)衍生化學(xué)發(fā)光DNA檢測(cè)技術(shù)，由以下部分構(gòu)成： 第一章：緒論 第一節(jié)，介紹了特定序列DNA檢測(cè)的研究進(jìn)展及其意義，內(nèi)容包括：熒光、電化學(xué)、表面基質(zhì)共振和石英微晶天平法等，并列舉了近年來它們?cè)谠摲治鲱I(lǐng)域的典型示例；第二節(jié)，介紹了主要的CL體系(如魯米諾體系、過氧化草酸酯體系、吖啶酯體系和堿性

4、磷酸酯酶體系)的原理、特點(diǎn)以及應(yīng)用，尤其是在免疫和DNA分析領(lǐng)域的應(yīng)用。第三節(jié)，闡述了本論文的目的和意義，指出了論文的主要研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新之處。 第二章：基于Poly T修飾的磁性微球表面瞬時(shí)衍生特定序列DNA化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)1．端粒特定序列檢測(cè)新技術(shù)端粒是染色體3’末端的重復(fù)性序列，由一種核糖核蛋白復(fù)合體——端粒酶在一定條件下合成。端粒和端粒酶具有保護(hù)細(xì)胞不被融合、降解的重要作用，它們最的多少與惡性腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因

5、此這一基因片段的測(cè)定對(duì)重大疾病的早期診斷和防治具有重要意義?；诖判晕⑶虮砻嫠矔r(shí)衍生化學(xué)發(fā)光，建立了一種新型的端粒特定序列DNA無標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。整個(gè)分析過程由以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟構(gòu)成：(1)dT<,20>修飾的磁性微球。與連接有dA<,20>，的捕獲探針雜交；(2)再與端粒特定序列DNA進(jìn)行第二次雜交；(3)磁性分離洗滌，基于 3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與端粒中富含的鳥嘌呤(G)反應(yīng)產(chǎn)生的特異性 CL，進(jìn)行端粒DNA的無標(biāo)記

6、檢測(cè)。結(jié)果表明：該法具有操作簡(jiǎn)便、分析快速和靈敏度高等特點(diǎn)。目標(biāo)序列濃度在 5-100 nM 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9918，最低檢測(cè)濃度為0.5 nM。 2．炭疽桿菌特定序列檢測(cè)新技術(shù)作為一種全球性的生化武器，炭疽桿菌引起了公眾以及軍事部門的熱切關(guān)注，建立實(shí)時(shí)有效的識(shí)別、檢測(cè)技術(shù)，對(duì)控制其傳播具有重要意義。本節(jié)以炭疽相關(guān)的一段含有 30個(gè)堿基的序列作為研究對(duì)象，構(gòu)建了無標(biāo)記CL檢測(cè)技術(shù)，并進(jìn)一步發(fā)展了基于G<,3

7、0>序列的放大檢測(cè)方法。放大檢測(cè)技術(shù)可描述如下：首先通過A<,20>-T<,20>雜交反應(yīng)將捕獲探針固定于磁性微球表面；捕獲探針15個(gè)核苷酸單位與目標(biāo)序列相應(yīng)序列段雜交結(jié)合；然后加入報(bào)告序列與目標(biāo)序列的另外15個(gè)核苷酸單位進(jìn)行第三次雜交反應(yīng)；利用TMPG與目標(biāo)序列和報(bào)告序列中富含的G堿基反應(yīng)產(chǎn)生的CL來檢測(cè)。報(bào)告序列含有兩個(gè)功能序列段：一是能夠與目標(biāo)序列的15個(gè)核苷酸單位雜交的序列段，另一個(gè)是富含 G 的序列段——(T<,2>G<,15

8、>)<,2>，結(jié)果表明：在6-60 nM的濃度范圍內(nèi)，CL 信號(hào)呈線性增加(R<'2>=0.9984)，最低檢測(cè)濃度為6 nM；采用G<,30>報(bào)告序列放大檢測(cè)技術(shù)，目標(biāo)序列在0.45-6 nM濃度范圍內(nèi)，線性良好(R<'2>=0.9917)，最低檢測(cè)濃度為 0.415 nM(0.045 pmol)：放大檢測(cè)技術(shù)較不放大技術(shù)靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，且對(duì) A-A 單堿基錯(cuò)配識(shí)別良好。 第三章：基于羧基修飾磁性微球表面瞬時(shí)衍生的無標(biāo)

9、記化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)本章以炭疽桿菌特定序列DNA為研究對(duì)象，采用羧基修飾的磁性微球?yàn)榉蛛x和預(yù)富集載體，通過羧基——氨基縮合反應(yīng)固定捕獲探針，雜交目標(biāo)序列后利用 G 堿基的特異性CL 反應(yīng)來檢測(cè)，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了G<,30>放大檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不放大檢測(cè)技術(shù)可表述為：在一定條件下，羧基磁性微球經(jīng)過EDC活化后，結(jié)合炭疽桿菌特定序列的捕獲探針，然后通過雜交反應(yīng)結(jié)合目標(biāo)序列，洗滌轉(zhuǎn)移后利用特異性反應(yīng)試劑 TMPG直接測(cè)定目標(biāo)序列中

10、的G堿基；G<,30>放大檢測(cè)技術(shù)是一種夾心方法，在上述第一步雜交完成后，加入一段富含G的報(bào)告序列，與目標(biāo)序列另外15個(gè)核苷酸單位進(jìn)行第二次雜交反應(yīng)，洗滌轉(zhuǎn)移后檢測(cè)TMPG與目標(biāo)序列和報(bào)告序列中富含的G反應(yīng)產(chǎn)生的CL信號(hào)。結(jié)果表明：該方法具有準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性和選擇性好的特點(diǎn)。目標(biāo)序列濃度在2-5 nM范圍內(nèi)，CL 信號(hào)呈線性增加(R<'2>=0.9962)，最低可檢測(cè)濃度為 2nM；G<,30>放大技術(shù)，目標(biāo)序列濃度在 50 pM-4

11、nM 范圍內(nèi)，CL 信號(hào)線性相關(guān)性良好(R<'2>=0.9965)，最低檢測(cè)濃度為50 pM，較不放大技術(shù)靈敏度提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。 第四章：基于碳納米管放大的特定序列DNA化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)本章以羧基修飾的磁性微球作為分離以及預(yù)富集載體，以碳納米管(CNTs)這種新型納米材料作為放大載體，發(fā)展了一種高靈敏度CL新技術(shù)檢測(cè)特定序列DNA。該技術(shù)利用夾心雜交檢測(cè)法：(1) 將氨基修飾的捕獲探針固定于經(jīng)過EDC活化的羧基修飾的磁性微球表

12、面；(2) 通過第一步雜交將目標(biāo)序列結(jié)合于磁性微球表面；(3)表面羧基功能化的碳納米管，經(jīng)過EDC活化后結(jié)合大量氨基修飾的報(bào)告序列形成放大復(fù)合物，通過第二步雜交反應(yīng)將放大復(fù)合物結(jié)合于磁性微球表面；(4) 檢測(cè) TMPG 與目標(biāo)序列和放大復(fù)合物中的 G 堿基反應(yīng)產(chǎn)生的CL信號(hào)。報(bào)告序列出兩個(gè)功能序列段組成：一是富含G的序列段，二是和目標(biāo)序列互補(bǔ)的序列段；各類CNTs經(jīng)過濃硫酸一過氧化氧(9∶1)的混合溶液氧化處理后形成表面羧基功能化的 C

13、NTs-COOH；通過TEM以及粒度/zeta電位測(cè)定儀對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行表征。研究了四種碳納米管的放大效果，并最終選用兩種作為載體進(jìn)行特定序列DNA 放大檢測(cè)；該方法不需要在測(cè)定前將待測(cè)組分從分離載體上洗脫下來，也不需要用酶、熒光染料等對(duì)核苷酸作進(jìn)一步的標(biāo)記，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可以在3-4 h 內(nèi)完成。 第五章：基于聚苯乙烯微球作為放大載體的特定序列DNA化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新技術(shù)本章以商品化的鏈霉親和素聚苯乙烯微球?yàn)榉糯筝d體平臺(tái)，構(gòu)建了一種省時(shí)、省

14、力、高效的放大檢測(cè)技術(shù)。與碳納米管作為放大載體的技術(shù)相比，不需對(duì)放大載體進(jìn)行表面功能化，節(jié)省分析時(shí)間，且利于放大技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。 第六章：基于DNAzyme的化學(xué)發(fā)光新技術(shù)檢測(cè)特定序列DNA利用羧基修飾的磁性微球作為高效分離載體，基于DNA催化酶(DNAzyme)催化Luminol和H<,2>O<,2>產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的原理，構(gòu)建了一種新型的磁性微球表面瞬時(shí)衍生特定序列DNA 檢測(cè)技術(shù)。包括以下分析步驟：(1)羧基磁性微球由EDC

15、活化后，固定氨基修飾的捕獲探針；(2)捕獲探針與目標(biāo)序列的15個(gè)寡聚核苛酸單位 (5’-AAT ATT GAT AAGGAT-3’)雜交；(3)目標(biāo)序列的另15個(gè)寡聚核苷酸犖．位(5’-GAG GGA TTA TTG TTA-3’)與報(bào)告序列的相應(yīng)序列段進(jìn)行第二次雜交，報(bào)告序列含有一段能夠自我折疊形成四聚體的序列——d(TTT GGG TAG GGC GGG TTG GG)，能夠特異性結(jié)合血紅素(Hemin)，形成具有HRP相似催化性能

16、的復(fù)合物(DNAzyme)；(4)用Luminol和H<,2>O<,2>在堿性條件與洗滌后的磁性微球反應(yīng)，產(chǎn)生CL進(jìn)行檢測(cè)?？疾觳?yōu)化了各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括磁性微球量、雜交時(shí)間和CL檢測(cè)條件等。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件檢測(cè)炭疽桿菌特定序列DNA，結(jié)果表明：該法具有操作簡(jiǎn)便和分析快速等特點(diǎn)，目標(biāo)序列濃度在0.2-20 nM濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9987，并在堿基錯(cuò)配分辨中有一定效果，為DNA檢測(cè)提供了一種有價(jià)值分析手段。

17、 第七章：基于Lumino-NaIO<,4->環(huán)糊精流動(dòng)注射的表面活性劑分析新技術(shù)這章內(nèi)容是較為早期的工作，旨在發(fā)展一種通用型的流動(dòng)注射CL分析技術(shù)，用于檢測(cè)各種類型的表面活性劑——陽離子型、陰離子型和非離子型表面活性劑。從工業(yè)制造、科學(xué)研究、家庭用品到環(huán)境污染物，表面活性劑是一類隨處可見的化合物。由于它們涉及到社會(huì)生活的方方面面，對(duì)于它們的研究顯得尤為重要。其中，發(fā)展相應(yīng)的分析檢測(cè)方法是對(duì)其研究的一個(gè)重要方向。本章發(fā)展的技術(shù)原理是：

18、在堿性溶液中，Luminol-NaIO<,4->多羥基化合物 (如：環(huán)糊精、葡萄糖和甘油等)體系的CL能夠被各種類型的表面活性劑不同程度的淬滅，在一定濃度范圍內(nèi)，淬滅程度與表面活性劑的濃度線性相關(guān)。我們研究了該現(xiàn)象的反應(yīng)機(jī)制，認(rèn)為淬滅原因在于多羥基化合物改變了CL反應(yīng)的微環(huán)境。據(jù)此發(fā)展了適應(yīng)于三種類型表面活性劑檢測(cè)的 CL 技術(shù)，陽離子型表面活性劑—CTMAB、陰離子型表面活性劑—SDS 和非離子型表面活性劑—Triton X-100。