煙草煙堿含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析及其候選基因預(yù)測(cè).pdf

1、煙堿是煙草重要的品質(zhì)性狀，明確煙堿含量的調(diào)控機(jī)制，篩選特異煙堿含量的煙草品種，對(duì)提高煙葉品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。然而，直接鑒定煙草種質(zhì)資源的煙堿含量周期很長(zhǎng)、效率偏低、消耗大量人力物力，影響了種質(zhì)資源的發(fā)掘利用。而利用分子標(biāo)記開(kāi)展特異煙堿種質(zhì)的篩選，則能夠有效縮短鑒定周期，節(jié)約成本，極大提高工作效率。近年來(lái)，雖有一些煙堿相關(guān)分子標(biāo)記挖掘工作得以開(kāi)展，但限于分子標(biāo)記密度不高、準(zhǔn)確度不夠等問(wèn)題，煙堿相關(guān)分子標(biāo)記很少被應(yīng)用到種質(zhì)資源的篩選上。

2、而隨著二代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，RAD測(cè)序技術(shù)因其所具有的基因組覆蓋均勻、成本低、周期短等特點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，得益于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，依賴(lài)于SNP標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析方法迅速發(fā)展為植物復(fù)雜數(shù)量遺傳性狀研究的有效手段。
　　本研究對(duì)219份烤煙品種開(kāi)展了RAD重測(cè)序，對(duì)29份烤煙品種開(kāi)展全基因組重測(cè)序，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，發(fā)掘與煙堿含量變異、煙堿合成關(guān)鍵基因表達(dá)量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn);同時(shí)針對(duì)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行

3、相應(yīng)候選基因的預(yù)測(cè)，功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)等工作，對(duì)煙草煙堿相關(guān)分子標(biāo)記挖掘，高煙堿品種選育等工作具有重要的指導(dǎo)意義。具體研究結(jié)果如下:
　　1.對(duì)219份烤煙品種進(jìn)行了RAD重測(cè)序，獲得了384，904個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)的群體分型數(shù)據(jù)，結(jié)合8個(gè)年點(diǎn)烤后煙葉煙堿含量表型鑒定，運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，在顯著性閾值之上共發(fā)掘到2個(gè)與煙堿含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分別位于1號(hào)染色體的69，912，063 bp處和2號(hào)染色體的81，115，79

4、4 bp處。針對(duì)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，基于煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)到2個(gè)候選基因，分別是Ntab0691660和Ntab0574860。候選基因Ntab0691660與擬南芥ATCYS6基因同源，推測(cè)Ntab0691660可能通過(guò)調(diào)控生物脅迫抗受能力相關(guān)通路參與了煙堿合成代謝的調(diào)控;候選基因Ntab0574860與水稻中的OSJMJ706基因同源，推測(cè)Ntab0574860可能與煙堿合成關(guān)鍵酶腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。對(duì)關(guān)聯(lián)分析挖掘到

5、的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的等位變異特異PCR(AS-PCR)標(biāo)記，關(guān)聯(lián)位點(diǎn)C1_69，912，063篩選到1個(gè)可用的標(biāo)記AP014，SNP位點(diǎn)C2_81，134，669緊鄰關(guān)聯(lián)位點(diǎn)C2_81，115，794，從該位點(diǎn)上篩選到2組擴(kuò)增帶型清晰的AS-PCR標(biāo)記:AP068和AP072。研究為高煙堿優(yōu)異等位基因型的發(fā)掘和高煙堿新品種的分子標(biāo)記輔助選擇提供了可用的標(biāo)記和基因資源。
　　2.對(duì)29份烤煙品種開(kāi)展了全基因組重測(cè)序，基于所揭示的

6、基因組序列變異，分析了普通煙草種4個(gè)PMT基因家族基因的SNP和Indel變異，篩選錯(cuò)義突變位點(diǎn)。在基因Ntab0153810(NtPMT2)的第1個(gè)外顯子內(nèi)第75個(gè)核苷酸位置上的SNP(C23_49502707)發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變。與參考基因組紅花大金元相比，該SNP在部分品種上由T突變?yōu)镚，從而導(dǎo)致翻譯后的氨基酸序列由組氨酸(H/His)變?yōu)楣劝滨０?Q/Gln)，其氨基酸性質(zhì)從堿性氨基酸變?yōu)轷０奉?lèi)氨基酸。方差分析結(jié)果表明，在顯著水平

7、上T基因型比G基因型供試品種的煙堿平均含量高14.7％，T基因型是高煙堿優(yōu)異等位變異。針對(duì)該位點(diǎn)，開(kāi)展了功能標(biāo)記轉(zhuǎn)化，篩選到1對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、帶型清晰的功能標(biāo)記AP058。本研究為高煙堿品種的分子標(biāo)記輔助選擇提供了可用的標(biāo)記和基因資源。
　　3.對(duì)219份烤煙品種進(jìn)行了煙堿合成關(guān)鍵基因PMT、QPT的表達(dá)量表型鑒定，結(jié)合RAD重測(cè)序所獲得的高質(zhì)量SNP數(shù)據(jù)，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，在顯著性閾值之上挖掘到2個(gè)與PMT表達(dá)量相關(guān)的SN

8、P位點(diǎn)，分別位于2號(hào)染色體的76585016 bp處和5號(hào)染色體的150848920 bp處;8個(gè)與QPT表達(dá)量顯著相關(guān)的關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)，分別位于2號(hào)染色體上的2177629bp和2177631 bp處、4號(hào)染色體上的150426307bp處以及9號(hào)染色體上的15845870bp、107612287bp、107612311bp、107612331bp和107612344bp處。利用水培的方法，在人工氣候培養(yǎng)室內(nèi)對(duì)煙草幼苗進(jìn)行培養(yǎng)，保證了