綿羊SPLUNC1基因的克隆、表達及活性檢測.pdf

1、綿羊支原體肺炎是一種能引發(fā)綿羊以咳嗽、喘氣、漸進性消瘦及肺間質的增生性炎癥為特征的慢性呼吸道疾病，對養(yǎng)羊業(yè)危害嚴重。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1（short palate，lung and nasal epithelium clone1，SPLUNC1）是一種在呼吸道上皮高表達的蛋白質分子，參與了宿主防御活動，具有抗菌和抗炎的功能，同時還能抑制肺炎支原體生長。本研究通過克隆巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因cDNA全長序列，對其進行

2、生物信息學分析，通過真核表達巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因，研究重組SPLUNC1蛋白對綿羊肺炎支原體的作用，驗證其生物活性，為下一步研究綿羊SPLUNC1蛋白的生物學功能奠定基礎。
　　本研究主要內容包括：⑴巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因全長cDNA的擴增：根據GenBank上已報道的牛的SPLUNC1基因序列，設計引物，使用RACE技術分別克隆巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的3’端序列和5’端序列，并測序、拼接獲得

3、巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的全長cDNA序列。⑵巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因全長cDNA的生物信息學分析：利用生物信息學軟件及在線分析工具對獲得的巴什拜羊與湖羊SPLUNC1基因全長cDNA序列進行核酸及其編碼蛋白信號肽、亞細胞定位、二級結構、三級結構、進化樹等生物信息學分析。⑶巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的克隆與表達：使用PCR方法擴增出巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的開放閱讀框序列，并將該序列連接至pPIC9

4、K真核表達載體，構建pPIC9K-SPLUNC1表達質粒，轉化至巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中進行誘導表達，優(yōu)化誘導表達條件并對表達產物進行 SDS-PAGE和 Western Blotting分析鑒定。⑷重組巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1蛋白的純化與生物活性研究：利用Ni柱純化方法分別對重組巴什拜羊與湖羊 SPLUNC1蛋白進行純化，將純化的蛋白作用于綿羊肺炎支原體，使用熒光實時定量法檢測純化蛋白對綿羊肺炎支原體的作用。⑸巴什拜

5、羊、湖羊SPLUNC1基因全長分別為1095bp和1091bp，核苷酸相似性為99％。⑹巴什拜羊、湖羊SPLUNC1的核苷酸序列有五處核苷酸堿基差異，但是二者的開放閱讀框均為768bp，編碼氨基酸相同，均為255個氨基酸。SPLUNC1蛋白質的分子量為26.53 KD，理論等電點為5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信號肽，亞細胞定位在細胞外。SPLUNC1蛋白質的二級結構主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲。該蛋白由4股反平行的肽段形成的β折疊片

6、和2個α螺旋組成的桶型結構域組成。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果說明，SPLUNC1蛋白與山羊首先聚為一類，后與牛聚為一類，這與動物學分類結果一致。⑺在巴斯德畢赤酵母 GS115中成功表達巴什拜羊與湖羊重組SPLUNC1蛋白，經SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，蛋白的分子量均為25.53kD，且在甲醇誘導72h表達的蛋白含量較高，經Western Blotting檢測證實表達蛋白為目的蛋白。⑻SDS-PAGE檢測純化的重組蛋白，結果顯示為單一的條帶，且分子