USP33抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是指發(fā)生于結(jié)腸或直腸中的癌癥，是最常見的惡性腫瘤類型之一，其發(fā)病率逐年升高。結(jié)直腸癌預(yù)后與腫瘤分期密切相關(guān)，已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期患者五年生存率低于15％。其中結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移(Colorectal cancer liver metastasis, CRCLM)是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，有20-25％的結(jié)直腸癌患者初次確診時(shí)已存在同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移(Synchronous liver m

2、etastasis)。即使對(duì)于根治性手術(shù)切除后的早期患者，仍然約有30％最終出現(xiàn)異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移(Metachronous liver metastasis)，對(duì)于CRCLM患者的治療方案取決于具體的臨床狀況和多學(xué)科評(píng)估，在患者耐受的情況下，手術(shù)切除仍然為最佳治療策略。但即使對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶均進(jìn)行手術(shù)切除，患者術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)率仍然居高不下。因此對(duì)CRCLM患者的治療及預(yù)后評(píng)估是提升結(jié)直腸癌整體生存率的關(guān)鍵。
　　CRCLM是一個(gè)十分復(fù)雜

3、的生物學(xué)過程，從解剖學(xué)的角度看，消化道的靜脈血流匯入門靜脈并進(jìn)入肝臟，因此肝臟是消化道腫瘤細(xì)胞最容易著床的臟器，癌細(xì)胞脫落并進(jìn)入血循環(huán)后，很容易在肝臟形成轉(zhuǎn)移灶。從腫瘤細(xì)胞的角度看，影響腫瘤轉(zhuǎn)移的因素包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移侵襲、腫瘤微環(huán)境等。雖然結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制尚不完全明確，但普遍認(rèn)為趨化因子-趨化因子受體(Chemokine receptor)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal t

4、ransition，EMT)過程發(fā)揮重要作用。
　　CXCR4(C-X-C chemokine receptor type4)是一種重要的趨化因子受體家族成員，屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCRs)家族，可被多種趨化因子激活并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移過程。CXCR4最主要的配體為CXCL12(C-X-Cmotif chemokine12)，又稱為SDF-1(Stromal cell-der

5、ived factor1)。腫瘤細(xì)胞表面受體CXCR4受到SDF-1刺激后，可激活G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)通路，調(diào)控下游EMT分子的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性。CXCR4被激活后會(huì)迅速發(fā)生由β-arrestin2蛋白所介導(dǎo)的受體內(nèi)吞過程，該內(nèi)吞過程受到CXCR4和β-arrestin2蛋白的磷酸化、泛素化等翻譯后修飾(Post-translational modification，PTM)調(diào)控。
　　泛素特異性蛋白酶USP33(Ubiqui

6、tin-specific protease33)屬于泛素特異性蛋白酶家族(Ubiquitin-specific proteases，USPs)成員之一，能夠調(diào)控底物的“去泛素化”過程，拮抗泛素連接酶(Ubiquitin ligases)所介導(dǎo)的泛素化修飾。USP33己被報(bào)道可參與調(diào)控多種GPCR的內(nèi)吞過程，包括β2腎上腺素受體(β2 adrenergic receptor，β2AR)和血管加壓素受體Ⅱ(Vasopressin recep

7、tor type2，V2R)等;但USP33在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究較少，其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能和分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。
　　本研究首次探索了USP33在CRCLM患者腫瘤組織中的表達(dá)變化，分析其與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，證實(shí)USP33蛋白表達(dá)水平對(duì)CRCLM患者預(yù)后的指導(dǎo)意義。此外，本課題表明USP33可抑制β-arrestin2所介導(dǎo)的CXCR4內(nèi)吞過程，阻斷其下游β-arrestin2依賴性ERK通

8、路，從而下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT蛋白表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究不僅進(jìn)一步明確了USP33調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，同時(shí)也闡明了β-arrestin依賴性的GPCR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。
　　第一部分:泛素特異性蛋白酶USP33與結(jié)直腸癌臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性
　　[目的]:
　　檢測CRCLM患者腫瘤組織（原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移腫瘤）中USP33的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性同時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)分

9、析評(píng)估USP33對(duì)CRCLM患者的總生存率(Overall survival，OS)和無病生存率(Disease-free survival, DFS)的預(yù)測價(jià)值。
　　[方法]:
　　1.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、山東大學(xué)千佛山醫(yī)院、單縣中心醫(yī)院和鄆城市人民醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤(CRC)、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤(CRCLM)及對(duì)應(yīng)癌旁石蠟組織，并制成石蠟組織切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤組織及癌旁組織中USP33

10、的蛋白表達(dá)及亞細(xì)胞定位，統(tǒng)計(jì)分析其與腫瘤病理特性、病人分期等相關(guān)性。
　　2.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、山東大學(xué)千佛山醫(yī)院、單縣中心醫(yī)院和鄆城市人民醫(yī)院手術(shù)切除的CRC、 CRCLM及對(duì)應(yīng)癌旁新鮮組織，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(Reversetranscription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)手段檢測腫瘤組織及癌旁組織中USP33的mRNA水平。

11、r>　　3.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、山東大學(xué)千佛山醫(yī)院、單縣中心醫(yī)院和鄆城市人民醫(yī)院手術(shù)切除的CRC、CRCLM及對(duì)應(yīng)癌旁新鮮組織，利用蛋白免疫印跡(Westernblot)手段檢測腫瘤組織及癌旁組織中USP33的蛋白水平。
　　4.回顧性統(tǒng)計(jì)分析病人生存資料，記錄其總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間，進(jìn)行Kaplan-meier生存分析和Cox多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，尋找影響CRCLM患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。
　　[結(jié)果]:
　　1.收

12、集139例CRCLM患者手術(shù)切除石蠟組織，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，USP33主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，且在CRC及CRCLM腫瘤組織中表達(dá)水平均低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。CRC中的USP33蛋白水平與CRC浸潤深度、肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān);CRCLM中的USP33蛋白水平與原發(fā)腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.收集14例CRCLM患者手術(shù)切除新鮮組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織，RT-qPCR結(jié)果顯示，有9例(9/14，64.3％)患者CRC

13、組織中USP33的mRNA水平低于癌旁結(jié)直腸組織，有12例(12/14，85.7％)患者CRCLM中USP33的mRNA水平低于癌旁肝臟組織。
　　3.14例CRCLM患者手術(shù)切除新鮮組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織的Western blot結(jié)果表明，有10例(10/14，71.4％)患者原發(fā)灶中USP33的蛋白水平低于癌旁結(jié)直腸組織，有12例(12/14，85.7％)患者肝轉(zhuǎn)移灶中USP33的蛋白水平低于癌旁肝臟組織。該結(jié)果基本與mRNA檢測

14、結(jié)果一致。
　　4.單因素分析結(jié)果顯示，CRCLM的分布、CRCLM數(shù)目、CRCLM最大腫瘤直徑、分化程度、手術(shù)切緣均可影響CRCLM患者的總生存率;此外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝外轉(zhuǎn)移以及USP33在腫瘤組織中的表達(dá)水平，也可影響患者的整體預(yù)后生存。影響患者腫瘤復(fù)發(fā)的因素包括:CRC浸潤深度、CRCLM分布、CRCLM數(shù)目、CRCLM最大腫瘤直徑、分化程度、手術(shù)切緣、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及CRCLM中USP33的表達(dá)水平。多因素分析進(jìn)一步證實(shí)C

15、RCLM中USP33的蛋白表達(dá)水平可作為獨(dú)立預(yù)后因素提示患者總生存及無病生存狀況。
　　[結(jié)論]:
　　1.USP33在結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤及肝轉(zhuǎn)移腫瘤中的表達(dá)水平均低于對(duì)應(yīng)癌旁組織，其可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。
　　2.USP33與CRCLM病理特征及分期明顯相關(guān)，USP33表達(dá)量低提示腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用更強(qiáng)。
　　3.USP33在CRCLM中的表達(dá)水平可作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素提示患者預(yù)后。
　　第二部分:U

16、SP33調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究
　　[目的]:
　　基于第一部分臨床結(jié)果表明，USP33在CRC組織和CRCLM組織中表達(dá)量均低于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤分期密切相關(guān)。本部分研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證USP33在結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　[方法]:
　　1.選用正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞和多種結(jié)直腸癌細(xì)胞系，應(yīng)用Western blot的方法，檢

17、測USP33的表達(dá)水平差異。
　　2.構(gòu)建帶有HA標(biāo)簽的pcDNA3.1-USP33高表達(dá)質(zhì)粒(HA-USP33)及空白對(duì)照質(zhì)粒(Vector)，訂購USP33特異性小干擾RNA(USP33-siRNA)及對(duì)照組siRNA(Negative control siRNA，NC-siRNA)，分別轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞以構(gòu)建USP33高表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞系，并利用Western blot的方法檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　3.對(duì)轉(zhuǎn)染后的USP33

18、高表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞分別進(jìn)行光學(xué)顯微鏡下觀察，確定其是否存在細(xì)胞形態(tài)改變等表型變化。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行SDF-1刺激，利用Western blot方法檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　4.利用USP33高表達(dá)及低表達(dá)的細(xì)胞系，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行SDF-1刺激，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測USP33對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響;進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound healing assay)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測USP33對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。
　

19、　[結(jié)果]:
　　1.USP33在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于其在結(jié)直腸癌細(xì)胞系(SW620細(xì)胞、SW480細(xì)胞、LoVo細(xì)胞)中的表達(dá)水平。在三種結(jié)腸癌細(xì)胞系中，SW620細(xì)胞的USP33表達(dá)量最低，SW480細(xì)胞表達(dá)量最高，LoVo細(xì)胞表達(dá)量居中。
　　2.成功構(gòu)建質(zhì)粒HA-USP33,并選用LoVo細(xì)胞系分別進(jìn)行HA-USP33及USP33-siRNA轉(zhuǎn)染，經(jīng)Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率及

20、USP33蛋白表達(dá)水平。
　　3.光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，USP33高表達(dá)可抑制LoVo細(xì)胞由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化。Western blot結(jié)果顯示，USP33高表達(dá)可抑制EMT標(biāo)志性蛋白表達(dá)(β-catenin，N-cadherin，Snail，Slug，Twist1)，同時(shí)上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá);而USP33低表達(dá)細(xì)胞則呈現(xiàn)與上述結(jié)果相反的EMT蛋白變化趨勢。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)US

21、P33可抑制LoVo細(xì)胞的增殖能力，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明USP33可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。
　　[結(jié)論]:
　　1.USP33可抑制SDF-1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT過程。
　　2.USP33可抑制SDF-1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移侵襲過程。
　　第三部分:USP33抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的分子機(jī)制研究
　　[目的]:
　　上述研究已證實(shí)USP33可通過下調(diào)EMT蛋白

22、進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，本部分實(shí)驗(yàn)將從分子生物學(xué)角度入手，進(jìn)一步探索USP33調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制。
　　[方法]:
　　1.檢測SDF-1所對(duì)應(yīng)的趨化因子受體CXCR4在臨床病理組織(CRC組織，CRCLM組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織)中的表達(dá)情況。
　　2.應(yīng)用RT-qPCR和Western blot的手段，分別檢測CXCR4在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的mRNA及蛋白水平。
　　3.構(gòu)建USP

23、33失活突變(C214S/H683Q)，并將其克隆入HA-pcDNA3.1載體質(zhì)粒中(HA-USP33Cys:His)，對(duì)LoVo細(xì)胞進(jìn)行HA-USP33Cys:His轉(zhuǎn)染。
　　4.對(duì)轉(zhuǎn)染HA-USP33Cys:His的LoVo細(xì)胞分別進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，以探索USP33的去泛素化酶活性對(duì)其抑癌功能的影響。
　　5.利用細(xì)胞表面受體ELISA的手段，檢測USP33對(duì)CXCR4受體的內(nèi)吞、降解及再循環(huán)回膜

24、過程的影響。
　　6.通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，探索USP33與β-arrestin2的相互作用，并檢測USP33對(duì)β-arrestin2泛素化水平及蛋白降解的影響。
　　7.檢測β-arrestin2在臨床病理組織(CRC組織，CRCLM組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織)中的表達(dá)情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，評(píng)估其與USP33表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　8.利用Western blot的手段，檢測USP33對(duì)CXCR4下游ERK(Extracel

25、lular signal-regulated kinases)通路的影響。通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)吞抑制劑(Dynasore)預(yù)處理，驗(yàn)證USP33是否通過調(diào)控CXCR4內(nèi)吞過程從而影響下游ERK通路。
　　9.對(duì)USP33低表達(dá)的LoVo細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)吞抑制劑預(yù)處理，并給予SDF-1刺激，通過MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測CXCR4內(nèi)吞失調(diào)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力的影響。
　　[結(jié)果]:
　　1.CXCR4在CR

26、C組織中的表達(dá)量高于癌旁結(jié)直腸組織,CXCR4在CRCLM組織中的表達(dá)量高于癌旁肝臟組織。
　　2.CXCR4在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的mRNA水平對(duì)比如下:SW480＞LoVo＞SW620。Western blot檢測的蛋白水平差異與mRNA結(jié)果基本一致。
　　3.經(jīng)DNA測序證實(shí)HA-USP33Cys:His質(zhì)粒構(gòu)建成功，經(jīng)Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)HA-USP33Cys:His轉(zhuǎn)染成功。
　　4.MTT及Tr

27、answell實(shí)驗(yàn)顯示HA-USP33能夠抑制LoVo細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，而HA-USP33Cys:His轉(zhuǎn)染并不能抑制LoVo細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)特性。
　　5.USP33可抑制SDF-1刺激后的CXCR4受體內(nèi)吞及降解過程。
　　6.免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，SDF-1刺激后，USP33可與β-arrestin2蛋白結(jié)合，并下調(diào)β-arrestin2的泛素化水平，但USP33并不影響β-arrestin2的總蛋白水平。

28、　　7.β-arrestin2在CRC和CRCLM腫瘤組織中的表達(dá)量均高于癌旁正常組織，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并未發(fā)現(xiàn)β-arrestin2與USP33蛋白水平的顯著相關(guān)性。
　　8.USP33低表達(dá)能夠延長CXCR4下游的ERK活化持續(xù)時(shí)間，但給予內(nèi)吞抑制劑預(yù)處理后，該延長作用消失。
　　9.USP33-siRNA可增強(qiáng)LoVo細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力，而給予內(nèi)吞抑制劑預(yù)處理后，該作用被顯著削弱。
　　[結(jié)論]:
　　1

29、.USP33的去泛素化酶活性是其發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵。
　　2.USP33可下調(diào)β-arrestin2的泛素化水平，且其泛素化修飾可能影響β-arrestin2的蛋白活性，而非蛋白降解。
　　3.USP33通過下調(diào)β-arrestin2的泛素化，抑制CXCR4的內(nèi)吞過程，致使SDF-1刺激后的CXCR4僅脫敏(desensitization)但不內(nèi)吞，從而阻滯了CXCR4內(nèi)吞后由β-arrestin2介導(dǎo)的ERK活化(β-ar