半胱氨酸雙加氧酶及其模型化合物催化反應機理和活性調(diào)控機制的理論研究.pdf

1、單核非血紅素鐵酶是一類重要的金屬蛋白酶，它參與許多重要的需氧的生化反應。在自然界中，好氧生物需要利用氧氣為其生命過程提供能量并完成各種新陳代謝過程。但是，大氣中氧分子的基態(tài)為三重態(tài)，而被氧化的有機底物的基態(tài)一般為單重態(tài)，這是一個自旋禁阻的反應過程。一方面，這意味著所有的有機物自發(fā)燃燒為二氧化碳和水是一個禁阻的過程；而另一方面，自旋禁阻也導致三重態(tài)的氧氣參加的反應是一個相當緩慢的動力學過程。在這種情況下，含有過渡金屬的氧活化酶被用來解決這

2、一問題。這些金屬蛋白酶可以高選擇性地催化和控制生物體內(nèi)各種有機物的氧化過程，并且它們活性中心的結構可以隨著催化功能的不同而發(fā)生變化。理解這些酶的催化反應機理和氧氣激活的活性調(diào)控機制是當前國際學術研究的熱點和前沿。
　　 半胱氨酸雙加氧酶(CDO)是一種單核非血紅素金屬蛋白酶，在哺乳動物細胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，在肝細胞內(nèi)尤其豐富。CDO在新陳代謝和生物轉(zhuǎn)化中起著關鍵作用。CDO催化半胱氨酸(Cys)的氧化反應生成半胱亞磺酸，這是Cys分解代

3、謝過程的第一步，在下一步的氧化過程中生成硫酸鹽或者?；撬帷DO對于維持生物體的健康有重要作用。
　　 CDO是一種新穎的單核非血紅素金屬蛋白酶。在單核非血紅素金屬蛋白酶中，它的反應活性中心的典型結構是2－組氨酸－1－羧酸鹽的面型三聯(lián)體結構。然而，在CDO中，第三個組氨酸咪唑基團取代了羧酸鹽配體的位置，形成了3－組氨酸面型三聯(lián)體結構。另外，Cys中的硫醇硫與附近的酪氨酸殘基中的C形成了一個硫醚鍵，這種罕見的Tyr－Cys結構被稱

4、為“交聯(lián)蛋白輔因子”。CDO的這些結構特性可能會對它的催化機理產(chǎn)生影響。
　　 相比于CDO的重要性，人們對這種非血紅素酶的反應機理卻知之甚少，且對提出的反應機理也存在諸多爭論。因為CDO的催化反應進行地非?？?，因此利用實驗手段很難捕捉到反應過程中相關的中間體，這就為進一步了解CDO帶來了困難。分子水平上的理論計算研究就顯得尤為重要，開展相關的理論研究工作是當今理論化學工作者面臨的一項重要任務。
　　 在本論文中，我們采

5、用密度泛函理論方法，對CDO及其模型化合物催化反應機理和活性調(diào)控機制進行了理論研究，內(nèi)容涵蓋了CDO的催化反應機理，氧氣激活機制以及CDO及其模型化合物的電子結構特性和電荷轉(zhuǎn)移路徑等。本論文主要創(chuàng)新成果如下：
　　 1.用密度泛函方法詳細地研究了CDO催化Cys的反應機理。我們以大鼠CDO(PDB ID：3ELN)的X射線晶體結構為初始構型，選取了包含組氨酸(His86，His88和His140)，底物Cys和雙氧分子在內(nèi)的鐵的

6、反應活性中心作為模型，討論了在單重態(tài)、三重態(tài)和五重態(tài)下，反應路徑中關鍵點的幾何構型和電子結構，并給出了勢能面。通過研究，我們提出了新的CDO反應機理，即“鐵近端氧”反應機理。
　　 結果表明：在這個反應機理中，反應由五步組成。首先，位于Fe和S之間的O(1)－O(2)鍵的擺動使得鐵近端氧原子O(1)接近S，而鐵遠端氧原子O(2)靠近Fe，這步反應經(jīng)過過渡態(tài)TS1生成了七元環(huán)中間體INT2。接著，隨著O(1)－O(2)鍵的斷裂和S

7、－O(1)鍵的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，第二個氧原子O(2)被轉(zhuǎn)移到底物的S中，反應結束并生成產(chǎn)物半胱亞磺酸。
　　 CDO的反應主要發(fā)生在高自旋五重態(tài)的勢能面上，決速步的活化能為15.7kcal.mol-1。結合五重態(tài)勢能面上各個關鍵點的電子結構變化，我們了解到：在第一步O(1)－O(2)鍵的擺動過程中，一個電子從π*oo軌道遷移到σ*x2-y2軌道中。5INT2的電子組態(tài)為π*xy2π*xz1π*yz1σ*z21σ*x2-y21，其中Fe

8、的氧化態(tài)為Ⅱ。在第二步反應中，O(1)-O(2)鍵的伸長和斷裂導致了中間體5INT3的生成，在這個化合物中，S原子具有自由基特性(ps=0.46)，這主要是由于S原子孤對電子中的一個電子轉(zhuǎn)移到O(1)原子上造成的。與此同時，F(xiàn)e轉(zhuǎn)移了一個電子到O(2)原子上，F(xiàn)e的氧化態(tài)由5INT2中的Ⅱ變?yōu)榱?INT3中的Ⅲ。在第三步反應中，前兩步反應提供了足夠的空間，S-O(1)鍵的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)生成了中間體5INT4。在最后兩步反應中，一個電子從硫氧

9、化物遷移到Fe-oxo體系中，生成了產(chǎn)物半胱亞磺酸，同時CDO中Fe的氧化態(tài)又變?yōu)棰颉?br>　　 “鐵近端氧”反應機理是一個伴隨大量放熱的分步反應機理。與之前de Visser課題組提出的“鐵遠端氧”反應機理相比，這兩個機理都是可行的，有競爭力的反應機理。本研究為人們進一步了解CDO催化反應機理提供了參考。
　　 有關結果被雜志Journal of Theoretical and Computational Chemistr

10、y接收。
　　 2.用密度泛函方法詳細地研究了CDO模型化合物在氧化反應過程中氧氣的激活模式，通過分析電子結構、成鍵類型和前線軌道，對硫醇配體及其相對位置是如何控制氧氣激活的進行了理論研究。我們選取了四個模型：兩個硫醇配體化合物[(iPrBIP)FeⅡ(SPh)(Cl)](A)和[(iPrBIP)FeⅡ(SPh)(OTf)](B)，兩個非硫醇配體化合物[(iPrBIP)FeⅡ(Cl)2](C)和[(iPrBIP)FeⅡ(OTf)

11、2](D)。在硫醇配體化合物中，相對于Fe的第六個開放位點，模型(A)的硫醇配體位于反式位置，而模型(B)的硫醇配體位于順式位置。另外，我們也研究了氧氣激活的兩個關鍵點：第一個關鍵點是氧氣結合到Fe的開放位點之前，這可以反映氧氣激活的本質(zhì)特性；第二個關鍵點是氧氣恰好結合到開放位點，而這可以反映氧氣和模型的相互作用。
　　 結果表明：硫醇配體對氧氣的激活是至關重要的，而且它的相對位置對決定氧氣激活路徑也有重要的影響。在硫醇配體模型

12、中，通過有效的相互作用，硫醇配體可以同時作為π給體和σ給體向FeⅡ轉(zhuǎn)移電荷。一方面，這降低了FeⅡ的有效核電荷和氧化還原勢；另一方面，通過降低結構的Lewis酸性，較強的電子給予能力降低了氧氣分子的結合能。硫醇配體為氧氣的激活提供了必要條件。硫醇配體的相對位置也對氧氣的激活起著重要的作用。當硫醇配體結合到反式位置時，F(xiàn)e的d軌道將會成為最高占據(jù)軌道，并作為σ給體向O(1)2p軌道轉(zhuǎn)移電荷，這將導致Fe的氧化和Fe-S鍵的斷裂。當硫醇配體

13、結合到順式位置時，S的π分子軌道將占據(jù)最高雙占據(jù)軌道，并作為σ給體向O(2)轉(zhuǎn)移電荷，從而導致硫醇配體中的S發(fā)生氧化反應。
　　 結合實驗數(shù)據(jù)，我們關聯(lián)了這四個(iPrBIP)FeⅡ化合物的氧化還原電勢和在反應過程中的電荷轉(zhuǎn)移量。結果發(fā)現(xiàn)，硫醇配體的電荷轉(zhuǎn)移量和相關的氧化還原勢是密切相關的。電荷轉(zhuǎn)移量越多，氧化還原勢越低。這意味著我們可以通過調(diào)整配體的電荷轉(zhuǎn)移能力來改進相關的模型。
　　 本研究為進一步了解CDO氧氣激活

14、機制提供了理論依據(jù)。
　　 有關結果發(fā)表在J.Phys.Chem.A(2012，116，5510-5517)雜志上。
　　 3.用密度泛函方法詳細地研究了CDO模型化合物和反應活性中心以及它們相應的硒代化合物，在通過氧氣激活進行催化反應的前兩步反應中，通過分析成鍵類型，前線軌道和電荷轉(zhuǎn)移路徑，對為什么CDO不能催化Sec的氧化而可以催化Cys的氧化的問題進行了理論研究，盡管Se的電荷轉(zhuǎn)移能力要強于S。我們選取了兩個模型：

15、一個CDO模型化合物和一個CDO反應活性中心(PDB ID：3ELN)。根據(jù)文獻已經(jīng)報道出的CDO催化機理，對前兩步反應過程中公認的三個關鍵點結構A，B和C進行了研究。它們分別是氧氣結合到Fe的第六個開放位點之前的結構A，氧氣恰好結合到開放位點的結構B和氧氣進攻S生成四元環(huán)的結構C。
　　 結果表明：在O2結合過程的第一步反應中，CDO硒代化合物中Se向Fe轉(zhuǎn)移電荷的能力要強于S。以CDO模型化合物為例，在結構A中，自旋向上的電

16、子成單地占據(jù)在Fe的四個d軌道中，F(xiàn)e的氧化態(tài)為Ⅱ。當結合了O2，在結構B中，F(xiàn)e將d軌道中的電荷轉(zhuǎn)移到OOπ*軌道中，F(xiàn)e的氧化態(tài)變?yōu)棰蟆＿@個結構與三價鐵過氧化物的特性一致。而在Se-CDO模型化合物中，F(xiàn)e也將d軌道中的電荷轉(zhuǎn)移到OOπ*軌道中，但由于Se更好的電荷轉(zhuǎn)移能力，它可以通過將Se4p軌道的電荷轉(zhuǎn)移到Fe的d軌道來補償Fe中心的電荷損失。這樣，在Se-CDO模型化合物的結構B中，F(xiàn)e的氧化態(tài)保持Ⅱ。
　　 在第二步

17、反應，四元環(huán)結構的形成過程中，S的電荷給予能量強于Se。隨著四元環(huán)結構的形成，S(Se)-O(2)鍵生成，同時Fe-O(1)鍵被削弱。在CDO模型化合物的結構C中，一方面，S將S3p軌道的電荷轉(zhuǎn)移到OOπ*軌道，與OOπ*軌道中的一個電子配對；另一方面，S可以向Fe的d軌道轉(zhuǎn)移電荷。在這個過程中，F(xiàn)e的氧化態(tài)重新變?yōu)棰?。而在Se-CDO模型化合物的結構C中，相比于Fe-S鍵，F(xiàn)e-Se鍵被更大地削弱了，Se只將Se4p軌道的電荷轉(zhuǎn)移到O

18、Oπ*軌道，而不是轉(zhuǎn)移給Fe。在反應過程中，F(xiàn)e始終保持Ⅱ價的氧化態(tài)。
　　 與模型化合物相似，在CDO反應活性中心中，F(xiàn)e中心氧化態(tài)的變化是Ⅱ→Ⅲ→Ⅱ，而在Se-CDO反應活性中心中，F(xiàn)e中心的氧化態(tài)始終保持Ⅱ價。
　　 在催化反應的前兩步反應中，S和Se之間的電荷轉(zhuǎn)移競爭導致了Fe中心氧化態(tài)的不同變化?？紤]到三價鐵過氧化物是這類反應中的活性氧化劑，所以，半胱氨酸化合物的Fe中心可以有效地催化O(1)-O(2)鍵的斷裂