人工合成寡核苷酸的液相色譜-質(zhì)譜研究.pdf

1、SNP分型和DNA甲基化在分子生物學(xué)中具有重要的研究意義，但它們傳統(tǒng)的分析方法存在較大的缺陷，而液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在SNP分型和DNA甲基化分析中顯示出良好的應(yīng)用前景。目前，應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用儀，特別是串級(jí)質(zhì)譜研究SNP分型和DNA甲基化鮮有報(bào)道，正處于起步階段。因此，本文將應(yīng)用高效液相色譜—串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS/MS)對(duì)人工合成寡核苷酸(ODNs)和甲基化修飾寡核苷酸樣品進(jìn)行研究，初步建立ODNs測(cè)序和甲基化定位的質(zhì)譜分析方法。本研

2、究可以為DNA加合物的質(zhì)譜分析奠定基礎(chǔ)，具有一定探索性，難度也較大。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.應(yīng)用RP-IP-HPLC對(duì)ODNs混合片段的分離，從片段長(zhǎng)度、堿基組成、末位堿基差異、片段內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及不同流動(dòng)相系統(tǒng)等方面討論了它們對(duì)ODNs片段在RP-IP-HPLC中保留行為的影響。
　　 2.應(yīng)用HPLC-MS/MS快速確定ODNs的分子量，并在合適條件下進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜分析得到片段序列信息，總結(jié)ODNs單級(jí)質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)

3、譜分析的普遍規(guī)律。
　　 3.應(yīng)用HPLC-MS/MS對(duì)兩組SNP分型寡核苷酸進(jìn)行分析。
　　 4.應(yīng)用HPLC-MS/MS對(duì)甲基化寡核苷酸進(jìn)行分析。
　　 5.此外，還對(duì)自制高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOFMS)進(jìn)行了調(diào)試，并應(yīng)用TOFMS分析ODNs。
　　 通過(guò)上述5個(gè)方面的研究，得出了以下結(jié)論：
　　 1.在RP-IP-HPLC中，片段長(zhǎng)度越短、片段(G+C)％越大的片段越早洗脫；室溫下僅末尾

4、堿基不同的四種ODNs的洗脫順序?yàn)镚＜C＜T＜A；在TEAA流動(dòng)相系統(tǒng)中，具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的ODNs較不具二級(jí)結(jié)構(gòu)的ODNs先洗脫;TEAA和TEAB流動(dòng)相系統(tǒng)中ODNs洗脫順序基本相同，主要受(G+C)％和片段長(zhǎng)度的影響，而在TEA-HFIP中ODNs的洗脫順序主要受片段長(zhǎng)度的影響，受(G+C)％的影響相對(duì)較??；此外，梯度洗脫時(shí)有機(jī)相梯度越大分離速度越快，分離分辨率越低。
　　 2.在HPLC-MS/MS中，ODNs母離子TIC強(qiáng)

5、度主要受片段堿基組成、不同流動(dòng)相系統(tǒng)、以及儀器參數(shù)(如CUR、IS等)影響；ODNs母離子電荷態(tài)分布主要受儀器DP值、不同流動(dòng)相系統(tǒng)、片段長(zhǎng)度以及進(jìn)樣方式的影響；ODNs子離子譜圖主要受碰撞能和電荷態(tài)的影響。碰撞能越大，碎片離子越多，碎片離子m/z分布越窄；在得到相似碎片離子譜圖時(shí)，高電荷態(tài)較低電荷態(tài)需較少的碰撞。
　　 3.應(yīng)用HPLC-MS/MS不僅能快速鑒定SNP分型類(lèi)別，而且可通過(guò)測(cè)序快速確定位于片段前端或后端的SNP位