誘餌寡核苷酸調(diào)節(jié)miR223的功能研究.pdf

1、背景：MicroRNAs(miRNA)是一類參與細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖以及腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)分子家族。miRNA與其靶mRNA在RISC中產(chǎn)生相互作用。miRNA與mRNA3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)的堿基配對(duì)方式是序列特異性的，因此與成熟miRNA有互補(bǔ)序列的寡核苷酸鏈也具有miRNA轉(zhuǎn)錄剪切和表達(dá)沉默的功能。miRNA可以通過序列匹配作用于眾多的靶mRNA分子，干擾他們的穩(wěn)定性及相關(guān)的蛋白翻譯。因此，一個(gè)重要miRNA功

2、能缺失，將導(dǎo)致大量靶mRNA改變，進(jìn)而影響細(xì)胞功能乃至機(jī)體整體的調(diào)節(jié)平衡。已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)RNA的3'UTR可以通過堿基配對(duì)的方式來調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中的miRNA的活動(dòng)，因此，具有與靶mRNAYUTR相似序列的寡核苷酸鏈也可作為誘餌寡核苷酸，競(jìng)爭(zhēng)性的與相應(yīng)的成熟miRNA結(jié)合。由此可以預(yù)測(cè)，誘餌RNA分子能夠作為外源競(jìng)爭(zhēng)RNA(cRNA)靶向作用于成熟miRNA，并選擇性的保護(hù)相應(yīng)的mRNAs。
　　目的：我們通過系統(tǒng)的研究來評(píng)估合成的誘

3、餌寡核苷酸對(duì)hsa-mir-223活動(dòng)的選擇性靶向作用，并將包含與成熟miR-223及靶mRNA3'UTR序列堿基配對(duì)位點(diǎn)的誘餌寡核苷酸用于檢測(cè)對(duì)miR-223活性的反向作用。
　　方法：根據(jù)成熟miR-22序列及其靶mRNA序列，利用在線演算法分析，設(shè)計(jì)并合成寡核苷酸誘餌。利用雙熒光素酶試驗(yàn)通過分別包含IGF1R，F(xiàn)OXO1，POLR3G，F(xiàn)OXO3，CDC27，F(xiàn)BXW7及PAXIP1等靶mRNA3'端非編碼區(qū)(即3'UTR)

4、的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中熒光素酶活性的變化來評(píng)估合成寡核苷酸誘餌對(duì)hsa-mir-223活性的影響。分別利用實(shí)時(shí)定量PCR與蛋白印跡用來測(cè)量誘餌寡核苷酸對(duì)miR-223靶向mRNA的表達(dá)水平的影響。利用CCK-8，MTT，酸性磷酸酶活性測(cè)定，集落形成實(shí)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞粘附到膠原的實(shí)驗(yàn)以及Hoechst染色等分別用于檢測(cè)寡核苷酸誘餌對(duì)miR-223參與的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、粘附及凋亡等生物功能的影響。
　　結(jié)果：除了與成熟miR-223全長(zhǎng)互補(bǔ)

5、的反義寡核苷酸，分別與成熟miR-2235'端，3'端或中間序列互補(bǔ)的誘餌寡核苷酸均抑制miR-223對(duì)IGF1R，F(xiàn)OXO1，F(xiàn)OXO3，CDC27，POLR3G，F(xiàn)BXW7等靶mRNA3'UTR的作用，并不同程度的挽救了miR-223所抑制的上述靶mRNA在mRNA和蛋白表達(dá)水平。因?yàn)镻AXIP1不是miR-223的靶點(diǎn)，所以所有誘餌寡核苷酸對(duì)其均沒有影響?；贗GF1R3'UTR所設(shè)計(jì)的誘餌寡核苷酸1是除外與成熟miR-223全長(zhǎng)

6、互補(bǔ)的反義寡核苷酸誘餌4，恢復(fù)IGF1R表達(dá)最明顯的寡核苷酸誘餌。對(duì)于具有與IGF1R3'UTR類似的與miR-223結(jié)合位點(diǎn)的FOXO3和POLR3G，誘餌1也表現(xiàn)出了顯著的挽救效應(yīng);而誘餌1未能恢復(fù)Sp1，CDC27和FBXW7的表達(dá)。
　　結(jié)論：本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明具有特異性序列的誘餌寡核苷酸可以作為競(jìng)爭(zhēng)性外源RNA選擇性的抑制miRNA對(duì)靶mRNA的作用。篩選并鑒別對(duì)miRNA靶向作用具有選擇性抑制作用的誘餌寡核苷酸對(duì)未來臨