蛋白質的定量分析新方法及其與小分子化合物的相互作用研究.pdf

1、蛋白質是生命科學的重要研究對象之一，其中人血清白蛋白(HSA)是人體內含量最豐富的運輸蛋白。HSA有許多重要的生理學和藥理學功能，能與許多內源和外源性物質如脂肪酸、氨基酸、荷爾蒙、陰陽離子和藥物等結合，起到存儲和轉運作用。人免疫球蛋白(γ-G)作為淋巴細胞的細胞表面受體在許多細胞活動中扮演著重要角色，同時在人體免疫應答中發(fā)揮著至關重要的作用。因此，HSA和Y-G已成為研究最廣泛的目標蛋白。發(fā)展高靈敏度、高選擇性的蛋白質定量分析新方法以及

2、研究毒性物質、藥物等小分子配體與蛋白質的相互作用機理和作用過程，在生命科學、臨床醫(yī)學、毒理學及藥代動力學上具有重要意義，該領域已成為從事生命科學、化學和臨床醫(yī)學等學科研究的科研工作者共同關注的課題之一。本論文基于研究蛋白質的定量分析新方法及小分子與蛋白質相互作用的重要意義及國內外研究趨勢，在總結前人工作的基礎上，綜合利用共振光散射光譜、熒光光譜、紫外．可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、圓二色性光譜、計算機分子模擬技術和動態(tài)激光散射技術，

3、從以下幾方面進行了創(chuàng)新性研究： 1、將自行組裝的全內反射及流動注射裝置與熒光光譜儀聯用，建立了測定人血清樣品中蛋白質含量的新方法，獲得了與蘭州大學第一醫(yī)院一致的結果。 2、研究了偶氮胂-TB、鈣試劑兩種染料和中藥活性組分大豆甙元與蛋白質的相互作用及結合機理，根據Scatchard方程和Stern-volmer方程計算了反應的結合常數和結合位點數，進而根據van’t Hoff方程求得反應的熱力學參數，討論了上述有機小分子與

4、蛋白質的主要作用力類型。 3、利用傅立葉變換紅外光譜技術和圓二色性光譜技術考察了蛋白質與有機小分子作用前后其二級結構的變化，并且采用計算機分子對接模擬技術研究了染料與人血清白蛋白的鍵合，提出了染料與人血清白蛋白相互作用的分子模型，獲得與實驗一致的結果。 4、研究了人免疫球蛋白在油包水型微乳液中與藥物大豆甙元的相互作用，并且與在水溶液中的相互作用進行了比較，同時利用熒光偏振技術和動態(tài)激光散射技術研究了微乳液水池大小對人免疫

5、球蛋白和大豆甙元相互作用的影響。論文共分為七章：第一章：簡要介紹了蛋白質的結構、功能和性質；綜述了蛋白質的定量分析方法及有機小分子與蛋白質相互作用的研究內容和研究方法。 第二章：基于測定水/四氯化碳(H<,2>O/CCl<,4>)界面的全內反射共振光散射(TIR-RLS)強度，建立了人血清樣品中蛋白質的定量分析新方法。在pH 4.10且有十六烷基溴化鈉(CTAB)存在的條件下，偶氮胂-TB與人血清白蛋白(HSA)的相互作用可導致

6、體系的TIR-RLS信號增強，最大散射峰位于330 nm處，增強的TIR-RLS強度與}tSA濃度在0.5-42.3 μg/mL范圍內成正比，檢測限(3σ)為198ng/mL。該方法已用于6個人血清樣品中蛋白質含量的測定，其最大相對標準偏差為1.2％，回收率在97-103％之間。 第三章：基于在pH 4.1的酸性條件下，蛋白質對甲基藍(MB)的共振光散射(RLS)信號有強烈增強作用的現象，建立了測定蛋白質的流動注射．共振光散射新

7、方法。在333 nm處增強的RLS強度與蛋白質濃度成正比。該體系中人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的線性范圍分別為2.0-37.3μg/mL和1.0-36.0μg/mL，檢測限(3σ)分別為45 ng/mL和80 ng/mL。該方法已成功地用于5個人血清樣品中蛋白質含量的測定，其最大相對誤差不超過為1％，回收率在98-102％之間，進樣率為60 h<'-1>。 第四章：基于在pH 4.1的酸性溶液中，蛋白質對酸性鉻

8、蘭K(ACBK)的共振光散射(RLS)信號有強烈增強作用的現象，建立了測定人血清樣品中蛋白質含量的流動注射-共振光散射新方法。在264 nm處增強的RLS強度分別與人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的濃度在2.0-40.0μg/mL和4.0-33.8μg/mL范圍內成正比，檢測限(3σ)分別為85 ng/mL和124 ng/mL。該方法已成功地用于6個人血清樣品中蛋白質含量的測定，其最大相對標準偏差不超過為2％，回收率在97

9、-103％之間，進樣率為60 h<'-1>。 第五章：利用共振光散射技術、傅立葉變換紅外光譜法和圓二色性光譜法研究了染料偶氮胂-TB(ATB)與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用。在最佳實驗條件下，計算了不同溫度下ATB與HSA相互作用的結合常數及結合位點數，根據熱力學參數確定了ATB與HSA之間的作用力類型，并定量分析了ATB與HSA的相互作用對HSA二級結構的影響。研究結果表明，結合常數及最大結合位點數隨著溫度的升高而降低

10、。由熱力學數據可知，ATB與HSA之間的結合是自發(fā)的、放熱的過程，并且以疏水作用為主；ATB的結合能使HSA的α-螺旋結構減少，β結構增加。 第六章：利用共振光散射技術、傅立葉變換紅外光譜法、圓二色性光譜法和分子模擬技術研究了染料鈣試劑與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用。光譜數據表明，鈣試劑與HSA相互作用的結合常數及最大結合位點數隨著溫度的升高而降低。由熱力學數據可知，鈣試劑與HSA之間的結合是自發(fā)的、放熱的過程，并且以疏

11、水作用為主。對HSA二級結構的研究表明，鈣試劑的結合能使HSA的α-螺旋及β-轉角結構減少、β-折疊結構增加。分子模擬結果顯示鈣試劑結合在HSA的ⅡA子域內。 第七章：利用熒光光譜法、紫外?？梢娢展庾V法、圓二色性光譜法和動態(tài)激光散射技術研究了模擬生理條件下在水/AOT/異辛烷的反相微乳介質中大豆甙元與人免疫球蛋白(γ-G)之間的相互作用。光譜數據表明，大豆甙元通過靜態(tài)機理猝滅γ-G的內在熒光，以單一結合部位與γ-G相互作用，其