黑蓋木層孔菌多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究.pdf

1、本論文主要通過(guò)生物發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)黑蓋木層孔菌；確定最優(yōu)培養(yǎng)基；并且從菌絲體和發(fā)酵液中提取、純化得到水溶性多糖；研究多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗腫瘤和免疫活性,并探討多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系。 首先篩選了適宜黑蓋木層孔菌菌絲體生長(zhǎng)的碳源和氮源。最優(yōu)碳源為可溶性淀粉,最優(yōu)氮源為玉米面,菌絲的生長(zhǎng)速度在有機(jī)氮源培養(yǎng)基上要明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源,確定蔗糖-玉米面為黑蓋木層孔菌的最佳碳-氮源組合。并且,該菌種適宜液體發(fā)酵培養(yǎng)。 黑蓋木層孔菌經(jīng)

2、發(fā)酵培養(yǎng)后,得到發(fā)酵菌絲體,確定菌絲體多糖的最優(yōu)提取條件為：提取溫度100℃,浸提4次,每次2小時(shí),浸提比1:30,各因素影響的大小次序是：提取次數(shù)>浸提比>浸提時(shí)間。 分別從菌絲體和發(fā)酵液中分離得到水溶性粗多糖：菌絲體粗多糖PNW和胞外粗多糖PNM。GC分析粗多糖組成:PNW由甘露糖和葡萄糖構(gòu)成,摩爾比為2.68:1.00;PNM由甘露糖、半乳糖和葡萄糖構(gòu)成,摩爾比為2.02: 1.00: 3.21。 采用凍融分級(jí)、脫

3、蛋白、離子交換層析和分子篩凝膠層析等方法,分別從PNW和PNM中純化出多糖PNW1和PNM1。HPLC檢驗(yàn)PNW1和PNM1均為單一峰,平均分子量分別為33 kDa和29 kDa。GC分析,PNW1和PNM1均為雜多糖,由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和巖藻糖組成,其摩爾比分別為3.26:8.77: 6.44: 1.00: 1.35和20.06: 8.72: 6.94: 1.00: 0.76。 采用部分酸水解、高碘酸氧化

4、、Smith降解、甲基化等化學(xué)分析方法及IR、GC、GC-MS、13C NMR等儀器分析方法對(duì)PNW1和PNM1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。確定了PNW1和PNM1的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元。PNW1的基本結(jié)構(gòu)為：1→6-Glc和1→6-Gal構(gòu)成主鏈,從Glc和Gal的0-2連接側(cè)鏈,側(cè)鏈由1→6-Man短鏈和Ara、Fuc、Man的末端構(gòu)成。PNM1的基本結(jié)構(gòu)為：1→6-G1c和1→6-Gal構(gòu)成主鏈,Glc的0-2連接側(cè)鏈,側(cè)鏈由1→6-Man短鏈和Ara

5、、Fuc、Glc、Man的末端構(gòu)成。建立BALB/c小鼠體內(nèi)S-180實(shí)體瘤模型,進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)。經(jīng)測(cè)定,菌絲體多糖和胞外多糖均能抑制小鼠體內(nèi)移植性腫瘤S-180的生長(zhǎng)。并且,菌絲體多糖％的抗腫瘤活性優(yōu)于胞外多糖。其中PNW1在400 mg/kg時(shí)抑瘤率最高,達(dá)到74.70％。在體外實(shí)驗(yàn)中,菌絲體多糖和胞外多糖對(duì)S-180細(xì)胞沒(méi)有的明顯抑制作用。菌絲體多糖和胞外多糖均有免疫調(diào)節(jié)功能,能增加荷瘤小鼠的脾相關(guān)系數(shù)和胸腺相關(guān)系數(shù),調(diào)節(jié)

6、血清中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。多糖與脾淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,表現(xiàn)出增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用,并且促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-α。推測(cè),其抗腫瘤作用是通過(guò)調(diào)節(jié)宿主的免疫機(jī)能實(shí)現(xiàn)的,可能與巨噬細(xì)胞有關(guān)。 PNW1和PNM1的分子量相近,在30 kDa左右,均由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和巖藻糖組成,各單糖的含量不同,結(jié)構(gòu)也不同,但是他們的結(jié)構(gòu)有共同的特點(diǎn)：主鏈?zhǔn)怯?→6-Glc和