河南華溪蟹金屬硫蛋白的表達(dá)與功能分析及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、環(huán)境污染，特別是水體污染是目前嚴(yán)重危害人類的危機之一，其中重金屬污染更為突出。隨著對環(huán)境重金屬污染的危害、生物耐受重金屬污染的細(xì)胞及分子機理、環(huán)境重金屬污染的生物修復(fù)方面的深入研究發(fā)現(xiàn)，金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）在重金屬解毒及環(huán)境污染監(jiān)測和生物修復(fù)中具有極為重要的作用。MT是一類廣泛存在于生物界，分子量較低(6～7 kDa)，富含半胱氨酸，缺少芳香族氨基酸和組氨酸，且能與多種重金屬結(jié)合的熱穩(wěn)定胞內(nèi)蛋白質(zhì)。大量研究

2、已經(jīng)證實，MT具有保持體內(nèi)必需金屬元素平衡和重金屬解毒的雙重機制，同時在清除自由基、抵抗氧化壓力，以及參與激素和發(fā)育過程調(diào)節(jié)等方面都具有重要作用。河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)由海洋蟹類多元進化而來，隸屬于甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）中的一個特殊分支，廣泛存在于我國山西省和河南省。作為生活于水體基底層的生物，河南華溪蟹直接面對沉積在水體的金屬離子，其MT的作用更為凸顯。本課題組在前期

3、研究工作中，系統(tǒng)研究了河南華溪蟹主要組織 MT表達(dá)以及與重金屬蓄積的關(guān)系，并完成了鎘誘導(dǎo)河南華溪蟹MT cDNA全長序列的克隆。為深入研究河南華溪蟹MT的理化特性和生物學(xué)功能，探究其在重金屬脅迫中的解毒機制，分析MT在重金屬污染生物修復(fù)和重金屬環(huán)境污染監(jiān)控及保護中應(yīng)用的可能性，本學(xué)位論文完成了以下四部分的研究工作。
　　1、河南華溪蟹金屬硫蛋白的表達(dá)及其抗重金屬脅迫能力研究
　　利用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)了河南華溪蟹M

4、T，經(jīng)Ni離子金屬螯合柱分離純化后，對其金屬結(jié)合及清除自由基能力進行了檢測；利用純化的融合蛋白SUMO-MT免疫BALB/c小鼠制備抗血清，間接ELISA檢測該抗血清的效價，Western blot和免疫組化染色檢測其特異性；采用定點突變技術(shù)對MT的一級結(jié)構(gòu)進行改造，構(gòu)建了兩種突變體SUMO-MTt1（N2C）和SUMO-MTt2（S36C），分別測定了MT及其突變體對Cu、Cd、Zn三種金屬的抗性及蓄積能力。結(jié)果表明，河南華溪蟹MT以

5、可溶形式獲得表達(dá)，經(jīng)金屬螯合層析純化后分析其仍具有金屬結(jié)合特性和清除羥自由基的生物學(xué)功能；免疫BALB/c小鼠后獲得特異性的抗MT抗血清，該抗血清具有較高的效價和良好的特異性，可識別組織MT，用于免疫組化分析；成功構(gòu)建了SUMO-MTt1（N2C）和SUMO-MTt2（S36C）兩種突變體，且較空菌體，三種轉(zhuǎn)MT或突變體工程菌對Zn2+、Cd2+和Cu2+三種重金屬的抗性及蓄積能力均有顯著提高，金屬離子在重組工程菌體內(nèi)的積累和抗性基本呈

6、現(xiàn)如下順序：SUMO-MTt1＞SUMO-MTt2＞SUMO-MT；針對同一價態(tài)、不同類型的金屬離子，三種工程菌對Cd2+的積累最大，而Zn2+和Cu2+的吸收能力相近。
　　2、河南華溪蟹金屬硫蛋白單克隆抗體的制備與鑒定
　　以重組融合蛋白SUMO-MT為免疫抗原、切割融合標(biāo)簽后MT為檢測抗原，利用雜交瘤技術(shù)建立抗河南華溪蟹MT mAb雜交瘤細(xì)胞株。采用間接ELISA測定mAb腹水效價，Western blot法、Dot-

7、ELISA分析mAb的特異性，疊加ELISA法鑒定了兩種單克隆抗體的抗原結(jié)合表位。結(jié)果顯示，成功建立了2株穩(wěn)定分泌抗MT蛋白的單克隆抗體（mAb）雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為mAb-MT2和mAb-MT3，均屬于IgG1亞類。腹水效價分別為1:5×105、1:1×106，Western blot和Dot-ELISA結(jié)果證實兩株mAb均能特異性識別重組MT和內(nèi)源性組織MT，疊加ELISA法測定兩種mAb具有同一的抗原識別位點。高特異性河南華溪

8、蟹MT mAb的制備、鑒定及其免疫學(xué)特性分析，為深入研究MT的生物學(xué)功能以及建立快速、敏感的新型免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
　　3、河南華溪蟹金屬硫蛋白的分泌表達(dá)與免疫親和純化及金屬結(jié)合能力
　　采用基因重組技術(shù)，將河南華溪MT基因亞克隆至phoA分泌型原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），通過低磷酸鹽誘導(dǎo)重組非融合型MT表達(dá)；利用單克隆抗體mAb-MT2免疫親和層析分離純化重組MT蛋白，紫外光譜掃描分析、SDS-P

9、AGE及Western blot鑒定；測定重組MT的自由基清除能力，分析其體內(nèi)金屬親和特性；MT經(jīng)體外重構(gòu)后，紫外掃描不同金屬/MT復(fù)合物，分析其體外金屬結(jié)合偏好。結(jié)果表明，利用phoA分泌表達(dá)系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了非融合MT的重組可溶表達(dá)，紫外光譜掃描和Western blot均證實表達(dá)產(chǎn)物的正確性，SDS-PAGE分析其純度較高，主要以單體和二聚體的形式存在，其分子量分別約為7.5kD和15kD；非融合MT具有與SUMO-MT一致的自由基

10、清除能力，在Zn、Cu、Cd三種不同金屬離子脅迫下，MT蛋白表現(xiàn)出不同的金屬親和力順序：Zn＞Cu＞Cd；經(jīng)體外重構(gòu)后，紫外光譜掃描結(jié)果顯示均形成單一金屬/MT復(fù)合物，進一步分析顯示，河南華溪蟹MT與Zn、Cu、Cd三種不同金屬離子幾乎具有一致的金屬結(jié)合能力，證實其屬于非金屬結(jié)合特異性MT而在體內(nèi)具有多種生理功能。本研究利用phoA分泌表達(dá)系統(tǒng)，實現(xiàn)了河南華溪蟹非融合型MT的可溶表達(dá)，并利用MT單克隆抗體建立了高效、簡便的免疫親和純化方

11、法，分析了MT體內(nèi)、體外金屬結(jié)合特性，為深入研究河南華溪蟹MT在體內(nèi)的生理功能奠定了理論基礎(chǔ)。
　　4、河南華溪蟹金屬硫蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測方法的建立
　　選擇具有良好免疫原性的河南華溪蟹重組SUMO-MT蛋白作為免疫抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，經(jīng)ELISA和Western blot檢測其特異性；以重組非融合河南華溪蟹MT作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，利用河南華溪蟹MT單克隆抗體mAb-MT3作為捕獲抗體，以純化的兔多克隆抗體作為

12、檢測抗體，通過棋盤滴定法確定最佳實驗條件，建立了河南華溪蟹MT雙抗體夾心ELISA檢測方法。結(jié)果顯示，捕獲抗體最佳稀釋倍數(shù)為1：12800，檢測抗體最佳稀釋倍數(shù)為1：6400；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0035x+0.0068(R2=0.9981)，其中x為MT蛋白濃度、y為OD450值，工作范圍為40～800ng/mL；該方法的檢測靈敏度為20.0ng/mL，批內(nèi)和批間差分別為4.22％和4.09%，具有良好的重復(fù)性。準(zhǔn)確、特異、靈敏的E