超電荷綠色熒光蛋白在生化傳感中的研究與應(yīng)用.pdf

1、超電荷綠色熒光蛋白(ScGFP)是一種表面帶很高凈電荷的新型功能蛋白，通過遺傳修飾的手段對綠色熒光蛋白進行表面重構(gòu)獲得的。ScGFP具有很強的水溶性和抗蛋白聚集的能力，在生物技術(shù)，醫(yī)藥和材料科學(xué)方面有著廣泛的應(yīng)用前景。此外，帶正電荷的ScGFP能夠穿透細胞膜，具有運載核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進入哺乳動物細胞內(nèi)的能力。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)運載體相比，ScGFP有細胞毒性低，轉(zhuǎn)運效率高和廣泛的細胞普適性等優(yōu)點。帶正電荷的ScGFP與帶負電荷的電核酸分

2、子之間通過靜電相互作用形成自組裝的多離子復(fù)合物，這與生物體中組蛋白和帶負電的DNA之間自組裝成染色質(zhì)的行為非常相似。ScGFP具有很強的穩(wěn)定性，穿透細胞膜的能力，以及與核酸之間有很強的靜電相互作用等特性，因此，可以基于ScGFP來開發(fā)用于生化分析的傳感平臺。但是到目前為止，ScGFP在生化檢測中的應(yīng)用還非常少。本文利用ScGFP(+36)作為識別和信號響應(yīng)元件，開發(fā)了一個基于ScGFP的簡單通用的傳感平臺，用于重大疾病相關(guān)的生物標志物的

3、檢測。本文的要點歸納如下：
　　(1)構(gòu)建用于原核表達ScGFP的重組載體，以及ScGFP的表達和純化。從ScGFP的氨基酸殘基序列反推出ScGFP的基因序列(scgfp)，并結(jié)合大腸桿菌偏好的密碼子系統(tǒng)對序列進行優(yōu)化。攜帶ScGFP的基因序列的質(zhì)粒pUC19-scgfp通過全基因人工合成的方式獲得。將質(zhì)粒pUC19-scgfp和pET28混合于一個PCR管中，然后通過“一鍋法”獲得重組質(zhì)粒pET28-scgfp。本文中發(fā)展的“一

4、鍋法”能夠在2 h內(nèi)完成重組質(zhì)粒的構(gòu)建工作，所有過程在同一個PCR管中完成，無需額外的DNA分離和回收步驟。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入pET28-scgfp大腸桿菌中，進行誘導(dǎo)表達ScGFP。在AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)上通過Ni-NTA柱和脫鹽柱進行純化，獲得了高純度的ScGFP。
　　(2)ScGFP與DNA之間的靜電相互作用。以20 bp的DNA作為模型，研究發(fā)現(xiàn)，ScGFP/DNA納米復(fù)合體形成速度非常快(20 s)，經(jīng)動態(tài)光

5、散射表征發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體的平均粒徑為568±46 nm，并且進一步地通過原子力顯微鏡表征得到證實。此外，能夠用共聚焦熒光顯微鏡直接觀察到ScGFP/DNA納米復(fù)合體。形成ScGFP/DNA納米復(fù)合體后，ScGFP的熒光增強了~40％，這可能是因為ScGFP分子的周圍微觀環(huán)境發(fā)生了改變。此外，ScGFP被包裹到ScGFP/DNA納米復(fù)合體中時，熒光各向異性顯著地降低，從0.3減小到0.07，這是由于復(fù)合體中緊鄰的ScGFP分子之間發(fā)生了hom

6、o-FRET。當(dāng)DNA被標記上猝滅基團時，ScGFP/DNA納米復(fù)合體中ScGFP的熒光被高效的猝滅，最大猝滅率達到了95%?；贒NA濃度依賴的熒光猝滅曲線，計算出ScGFP與20 bp的DNA的解離常數(shù)(Kd)為0.33 nM。
　　(3)ScGFP作為簡單而通用的探針用于DNA檢測和DNA甲基化分析。作為一個原理的驗證，本文發(fā)展了ScGFP的一個新的應(yīng)用領(lǐng)域，即作為一個通用的傳感平臺用于核酸檢測和表觀遺傳學(xué)分析。將ScGFP

7、作為信號報道分子，基于多離子的ScGFP/DNA納米復(fù)合物和支點介導(dǎo)的鏈取代反應(yīng)，發(fā)展了一個簡單的“turn-on”模式來檢測DNA的新方法。該分析方法具有較高的靈敏度(檢測限1nM)和很好的區(qū)分單堿基錯配的能力(目標DNA序列與單堿基錯配的序列的信號相差10倍)。此外，與重亞硫酸鹽處理相結(jié)合，這個基于ScGFP的分析方法被進一步用于高靈敏地分析結(jié)腸癌組織樣品的基因組DNA中特定位點的甲基化水平。
　　(4)ScGFP作為一個通用

8、的傳感平臺用于核酸酶和甲基轉(zhuǎn)移酶酶活性分析。本文中，基于多離子的ScGFP/DNA納米復(fù)合體，發(fā)展了一個靈敏的“switch-on”模式的生物傳感平臺，用于限制性和非限制性核酸酶，以及甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析。S1核酸酶對探針DNA的切割導(dǎo)致猝滅基團從探針上釋放和遠離ScGFP，繼而使得 ScGFP的熒光得到恢復(fù)。因此，實現(xiàn)了對S1核酸酶活性簡單的“turn-on”模式的分析，該分析方法具有較寬的線性范圍(0.008–0.4 U/mL)和低

9、的檢測限(0.002 U/mL)。基于同樣的傳感策略，對探針DNA進行適當(dāng)改變，該分析方法實現(xiàn)了對限制性內(nèi)切酶EcoRI高靈敏度分析(檢測限1.3 U/mL)。類似地，借助甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶DpnI，本方法又進一步應(yīng)用到Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測和抑制劑分析。
　　(5)H39GFP作為一個新型傳感平臺用于免標記檢測金屬離子和酶活性。蛋白表面重構(gòu)是對一個蛋白質(zhì)的表面進行重新設(shè)計，而保留蛋白原有的折疊和功能的技術(shù)。H39GFP，

10、一種通過蛋白表面重構(gòu)技術(shù)開發(fā)出的一級結(jié)構(gòu)中包含了39個組氨酸殘基的新型綠色熒光蛋白。H39GFP有很多優(yōu)良的性質(zhì)，包括異常的穩(wěn)定性，穿透細胞膜的能力和可調(diào)控的表面凈電荷等。本文中，利用H39GFP作為信號識別和報道分子，基于Cu2+的熒光猝滅效應(yīng)和H39GFP的多價的金屬離子結(jié)合位點，開發(fā)了一個免標記的Cu2+熒光傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，H39GFP與Cu2+之間的結(jié)合速度很快并且具有很高的結(jié)合力(Kd=16.2 nM)。該分析方法提供了一個

11、簡單的“混合-讀取”的方式來檢測Cu2+,對50 nM–2.0μM的Cu2+有線性響應(yīng)，最低檢測濃度為50 nM。此外，進一步將基于H39GFP的Cu2+分析方法用于乙酰膽堿酯酶(AChE)活性檢測及其抑制劑篩選。AChE水解硫代乙酰膽堿(ATC)生成硫代膽堿(thiocholine),硫代膽堿與Cu2+反應(yīng)生成Cu-(thiocholine)2，從而使 H39GFP的熒光恢復(fù)，實現(xiàn)“switch-on”模式檢測AChE活性。本方法實現(xiàn)