基于超電荷綠色熒光蛋白及量子點的熒光傳感新方法.pdf

1、現(xiàn)今，人類身體健康問題已成為全民關(guān)注的熱點。而疾病的發(fā)生是威脅人類生命安全最主要的方面。研究表明疾病的發(fā)生與體內(nèi)生物酶的不正常表達(dá)及某些重要營養(yǎng)元素含量的高低有關(guān)。人類許多重大疾病如癌癥、遺傳性疾病都與DNA甲基化以及甲基化酶的活性密切相關(guān);85-90％癌癥的發(fā)生都與端粒酶的活性有關(guān)。同時DNA甲基化酶和端粒酶可以作為早期癌癥診斷的標(biāo)志及腫瘤治療的靶點。另外，抗壞血酸（維生素C）是一種對人類非常重要的營養(yǎng)元素，其含量高低常作為某些疾病診

2、斷（如敗血癥）及營養(yǎng)分析的重要指標(biāo)。因此實現(xiàn)DNA甲基化酶活性、端粒酶活性及抗壞血酸含量的靈敏檢測具有非常重要的現(xiàn)實意義。基于此，本論文利用新型熒光納米材料（熒光蛋白、量子點）獨特的光學(xué)性質(zhì)，開發(fā)了三種無標(biāo)記的熒光分析方法分別用于DNA甲基化酶、端粒酶活性及抗壞血酸的檢測，具體工作如下:
　　(1)基于超電荷綠色熒光蛋白(supercharged green fluorescent protein，scGFP)熒光和帶正電荷的雙重

3、性質(zhì)以及氧化石墨烯(GO)的熒光猝滅能力，開發(fā)了一種DNA甲基化酶及其抑制劑5-氟尿嘧啶的檢測方法。scGFP可通過非共價結(jié)合力吸附在氧化石墨烯上，進(jìn)而猝滅scGFP的熒光。而帶負(fù)電的DNA能與scGFP結(jié)合，使scGFP聚集，從而保留scGFP的熒光不被氧化石墨烯猝滅。在此基礎(chǔ)上，合理設(shè)計探針序列，該探針可發(fā)生Dam甲基化酶及限制性內(nèi)切酶DpnⅠ雙耦合作用，進(jìn)而引發(fā)非模板依賴的基于TdT酶的DNA擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)形成的長鏈DNA能與

4、scGFP集合，使其聚集，保留scGFP的熒光。因此，通過溶液熒光的變化可實現(xiàn)對Dam甲基化酶及其抑制劑的檢測。該方法對Dam甲基化酶的檢測有較寬的線性范圍(0.1U/mL～100U/mL)，且有較低的檢測限(0.1U/mL)。本方法操作簡單、靈敏度高、無需復(fù)雜昂貴的DNA修飾過程。本方法還可以拓展到其他核酸酶及其抑制劑的檢測。
　　(2)基于超電荷綠色熒光蛋白(scGFP)熒光和帶正電荷的雙重性質(zhì)及G-四鏈體-hemin復(fù)合物的

5、熒光猝滅性質(zhì)，構(gòu)建了一種熒光分析方法用于端粒酶活性的檢測。端粒酶能以自身RNA為模板合成重復(fù)的富G序列(TTAGGG)，進(jìn)而引發(fā)等溫鏈取代反應(yīng)，生成更多的富G序列。這些富G序列在hemin存在下，形成G-四鏈體-hemin復(fù)合物，通過靜電作用與scGFP結(jié)合，并猝滅scGFP的熒光。通過溶液熒光強度的變化可實現(xiàn)對端粒酶活性的檢測。該方法對端粒酶活性的檢測有較寬的線性范圍(100-1000cells)，且有較低的檢測限(60cells)。

6、
　　(3)基于量子點獨特的熒光性質(zhì)及抗壞血酸的還原性，構(gòu)建了一種新型的熒光分析方法用于抗壞血酸的檢測?？箟难崮苓€原Pb2+，進(jìn)而破壞PbS的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致BSA-PbS量子點熒光的猝滅。該方法對抗壞血酸有較低的檢測限(0.83μM)，并成功運用于實驗水果樣品抗壞血酸含量的檢測，且在添加回收實驗中獲得了比較滿意的回收率(95.2-97.9％)。與以往基于量子點的抗壞血酸的檢測方法相比，該方法中的量子點制備簡單、不需要復(fù)雜的修飾過程，