蛋白A-增強型綠色熒光蛋白融合基因的構建、表達及其在免疫測定中的應用研究.pdf

1、開發(fā)和應用新的免疫標記物，其目的是為了提高免疫測定的靈敏度、特異性，使測定過程簡單、快速。利用基因工程技術直接將抗體或抗原與標記物(如酶)以融合方式表達，可避免繁瑣且低效率的酶與蛋白質的化學交聯(lián)，而且無需先得到純化的標記物和抗體或抗原。本研究中將增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)基因與葡萄球菌蛋白A(staphylococcalproteinA，SPA)基因重組，表達既有EGF

2、P熒光活性又有蛋白A生物學活性的雙功能蛋白質并應用于免疫測定中。EGFP的熒光特性使免疫反應呈綠色熒光可以直接觀測，而蛋白A能與多種哺乳動物血清中IgG的Fc段非特異性結合，嘗試開發(fā)一種特異、靈敏、簡便和快速的新型免疫親和試劑。 我們根據(jù)pEZZ18質粒(含蛋白A基因)和EGFP基因(pT1EGFP-N1質粒)序列，設計一對引物，通過PCR擴增得到EGFP基因，構建原核表達載體pEZZ-EGFP。由于EGFP產(chǎn)生熒光不需要加入任

3、何外源底物、酶或其他輔助因子，而且，EGFP發(fā)射的熒光用肉眼或熒光顯微鏡就可以觀測到。在轉入pEZZ-EGFP質粒的細菌中表達EGFP融合蛋白可使菌落呈現(xiàn)綠色，可在氨芐青霉素抗性平板上直接篩選綠色菌落，即為陽性重組轉化子。在原核表達載體pEZZ-EGFP系統(tǒng)中，外源基因表達由Lac啟動子與金黃色葡萄球菌蛋白A啟動子雙重控制非誘導型表達，有利于外源蛋白的分泌。利用金黃色葡萄球菌蛋白A的信號肽序列，可將外源基因的表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。另外

4、5'端蛋白A的IgG結合區(qū)序列(ZZ)，亦可以提高外源蛋白的可溶性，提高其分泌效率。 利用大腸桿菌表達PA-EGFP融合蛋白，通過對表達產(chǎn)物的純化、熒光活性和ELISA競爭實驗，表明構建的原核表達載體pEZZ-EGFP中ZZ序列、EGFP序列和6×His序列在EcoliDH5α都已正確表達；SDS-PAGE法測定的PA-EGFP融合蛋白相對分子量與理論值相近，具有綠色熒光蛋白及蛋白A兩者的生物活性，且PA-EGFP融合蛋白的熒光

5、激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜(Ex=489nm，Em=511nm)與報道相一致。PA-EGFP融合蛋白的熒光強度與其濃度的線性關系較好(r=0.99848)，只需對培養(yǎng)上清進行熒光強度測量即可簡單、快速地檢測液體培養(yǎng)基中PA-EGFP分泌表達水平的高低。利用E.coliDH5α表達PA-EGFP融合蛋白，在LB液體培養(yǎng)基中同時含有終濃度1％TritonX-100及1％甘氨酸，可使液體培養(yǎng)基中PA-EGFP融合蛋白的分泌表達量提高6倍以上(6.

6、44mg/L)。 利用PA-EGFP檢測包被于NC膜的兔IgG抗體，在紫外燈(365nm)下其檢測靈敏度為50ng，低于HRP/DAB檢測(6.25ng)，但PA-EGFP檢測不需底物顯色等步驟，與HRP/DAB檢測相比較，其檢測過程更加簡單、快速。在免疫細胞化學實驗中，兔抗大鼠Actin多抗為一抗標記大鼠神經(jīng)神經(jīng)細胞，PA-EGFP為替代二抗，檢測PA-EGFP的標記效果。熒光顯微鏡視野中有許多亮綠色熒光網(wǎng)狀結構，可較好地觀察