蛋白A-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合基因的構(gòu)建、表達(dá)及其在免疫測定中的應(yīng)用研究.pdf

1、開發(fā)和應(yīng)用新的免疫標(biāo)記物，其目的是為了提高免疫測定的靈敏度、特異性，使測定過程簡單、快速。利用基因工程技術(shù)直接將抗體或抗原與標(biāo)記物(如酶)以融合方式表達(dá)，可避免繁瑣且低效率的酶與蛋白質(zhì)的化學(xué)交聯(lián)，而且無需先得到純化的標(biāo)記物和抗體或抗原。本研究中將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)基因與葡萄球菌蛋白A(staphylococcalproteinA，SPA)基因重組，表達(dá)既有EGF

2、P熒光活性又有蛋白A生物學(xué)活性的雙功能蛋白質(zhì)并應(yīng)用于免疫測定中。EGFP的熒光特性使免疫反應(yīng)呈綠色熒光可以直接觀測，而蛋白A能與多種哺乳動(dòng)物血清中IgG的Fc段非特異性結(jié)合，嘗試開發(fā)一種特異、靈敏、簡便和快速的新型免疫親和試劑。 我們根據(jù)pEZZ18質(zhì)粒(含蛋白A基因)和EGFP基因(pT1EGFP-N1質(zhì)粒)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增得到EGFP基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pEZZ-EGFP。由于EGFP產(chǎn)生熒光不需要加入任

3、何外源底物、酶或其他輔助因子，而且，EGFP發(fā)射的熒光用肉眼或熒光顯微鏡就可以觀測到。在轉(zhuǎn)入pEZZ-EGFP質(zhì)粒的細(xì)菌中表達(dá)EGFP融合蛋白可使菌落呈現(xiàn)綠色，可在氨芐青霉素抗性平板上直接篩選綠色菌落，即為陽性重組轉(zhuǎn)化子。在原核表達(dá)載體pEZZ-EGFP系統(tǒng)中，外源基因表達(dá)由Lac啟動(dòng)子與金黃色葡萄球菌蛋白A啟動(dòng)子雙重控制非誘導(dǎo)型表達(dá)，有利于外源蛋白的分泌。利用金黃色葡萄球菌蛋白A的信號(hào)肽序列，可將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。另外

4、5'端蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)序列(ZZ)，亦可以提高外源蛋白的可溶性，提高其分泌效率。 利用大腸桿菌表達(dá)PA-EGFP融合蛋白，通過對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的純化、熒光活性和ELISA競爭實(shí)驗(yàn)，表明構(gòu)建的原核表達(dá)載體pEZZ-EGFP中ZZ序列、EGFP序列和6×His序列在EcoliDH5α都已正確表達(dá)；SDS-PAGE法測定的PA-EGFP融合蛋白相對(duì)分子量與理論值相近，具有綠色熒光蛋白及蛋白A兩者的生物活性，且PA-EGFP融合蛋白的熒光

5、激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜(Ex=489nm，Em=511nm)與報(bào)道相一致。PA-EGFP融合蛋白的熒光強(qiáng)度與其濃度的線性關(guān)系較好(r=0.99848)，只需對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行熒光強(qiáng)度測量即可簡單、快速地檢測液體培養(yǎng)基中PA-EGFP分泌表達(dá)水平的高低。利用E.coliDH5α表達(dá)PA-EGFP融合蛋白，在LB液體培養(yǎng)基中同時(shí)含有終濃度1％TritonX-100及1％甘氨酸，可使液體培養(yǎng)基中PA-EGFP融合蛋白的分泌表達(dá)量提高6倍以上(6.

6、44mg/L)。 利用PA-EGFP檢測包被于NC膜的兔IgG抗體，在紫外燈(365nm)下其檢測靈敏度為50ng，低于HRP/DAB檢測(6.25ng)，但PA-EGFP檢測不需底物顯色等步驟，與HRP/DAB檢測相比較，其檢測過程更加簡單、快速。在免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，兔抗大鼠Actin多抗為一抗標(biāo)記大鼠神經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞，PA-EGFP為替代二抗，檢測PA-EGFP的標(biāo)記效果。熒光顯微鏡視野中有許多亮綠色熒光網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可較好地觀察