紫色紅曲霉PigE基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、紅曲色素（Monascus pigments）是紅曲霉代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的天然色素，其具有多種生物活性廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品等行業(yè)。提高紅曲色素產(chǎn)量的同時降低真菌毒素—桔霉素(Citrinin)的含量是紅曲色素發(fā)酵生產(chǎn)過程中研究者普遍關(guān)注的焦點。紅曲霉產(chǎn)色素相關(guān)基因的研究為構(gòu)建高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉基因工程菌株提供了參考。
　　本文從紫色紅曲霉(Monascus purpureus)M-21菌株基因組DNA中克隆

2、獲得紅曲色素代謝相關(guān)基因PigE，并依據(jù)同源重組原理成功對PigE基因進(jìn)行敲除。通過探究PigE基因缺失突變株(△PigE)的生長代謝變化分析了PigE基因功能，最后對紅曲色素的穩(wěn)定性和抑菌性進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1、高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株的篩選與鑒定
　　從全國各地紅曲相關(guān)制品中分離純化獲得238株紅曲霉菌株，分別采用分光光度法和HPLC法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中紅曲色素產(chǎn)量和桔霉素含量，最終篩選獲得一株紅曲色素

3、產(chǎn)量達(dá)284.71U/g，桔霉素含量僅為1.1mg/L的高產(chǎn)色素低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌株M-21，經(jīng)鑒定為紫色紅曲霉（Monascus purpureus）。
　　2、PigE基因的克隆與敲除
　　根據(jù)基因序列同源性設(shè)計引物，從M.purpureus M-21基因組DNA中擴增獲得紅曲色素代謝相關(guān)基因PigE，該基因全長1199bp，編碼342個氨基酸?；谕粗亟M原理，以潮霉素抗性基因（hph）作為篩選標(biāo)記，體外構(gòu)建PigE基

4、因的敲除載體，并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功獲得116株紅曲霉轉(zhuǎn)化子。最后，通過hph抗性平板篩選、PCR驗證、Southern blot等方法篩選獲得一株△PigE突變株。
　　3、△PigE突變株生長代謝分析
　　對△PigE突變株的生長代謝和PigE基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明:△PigE突變株的菌落形態(tài)發(fā)生較大改變，而顯微結(jié)構(gòu)特征、生長速率無明顯改變。PigE基因的缺失主要引起紅曲色素的種類和產(chǎn)

5、量的改變。野生型菌株M.purpureus M-21以產(chǎn)生紅色素為主，同時產(chǎn)生少量黃色素。△PigE突變株喪失了產(chǎn)生紅色素的能力但產(chǎn)生黃色素的種類增多，且其采用紅曲米固體發(fā)酵13d后產(chǎn)生的紅曲色素色價值達(dá)1050U/g，較野生型M.purpureus M-21菌株提高約1.84倍?！鱌igE突變株接種于YES液體培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵13d后發(fā)酵液中桔霉素含量為1.57mg/L，其代謝產(chǎn)桔霉素的時間延遲但產(chǎn)量無顯著變化。RT-PCR分析結(jié)果表明

6、△PigE突變株因PigE基因缺失而無表達(dá)。
　　4、紅曲色素的穩(wěn)定性和抑菌性分析
　　提取M.purpureus M-21菌株和△PigE突變株發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素分別分析其穩(wěn)定性和抑菌性。紅曲色素穩(wěn)定性分析表明:在60℃，pH=7～9的環(huán)境中，紅曲色素的穩(wěn)定性好。紅曲色素對氧化劑NaClO4和還原劑Na2SO3作用不敏感。與Mg2+、Ca2+、K+、Cu2+相比，紅曲色素在Na+溶液中穩(wěn)定性最好。紅曲色素抑菌性分析表明:在