UPF0118家族中一個(gè)具有鈉-氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的未知功能蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、中度嗜鹽菌(Halophilic bacteria)泛指能夠在3％-15％的NaCl存在時(shí)表現(xiàn)出最適生長(zhǎng)的微生物類(lèi)群。中度嗜鹽菌與一般的非嗜鹽性細(xì)菌相比較，具有特殊的代謝途徑、生理生化結(jié)構(gòu)、以及獨(dú)特的遺傳學(xué)特性。喜鹽芽孢桿菌（Halobacillus sp.）NEAU-ST10-40是本實(shí)驗(yàn)室從安達(dá)市分離得到的一株中度嗜鹽菌，并已經(jīng)鑒定該菌株代表喜鹽芽孢桿菌屬（Halobacillus）的一個(gè)新種，并將其命名為安達(dá)喜鹽芽孢桿菌（Halo

2、bacillus andaensis）模式菌株NEAU-ST10-40T。
　　本研究采用大腸桿菌（Escherichia coli）缺陷株KNabc（△nhaA，△nhaB，△chaA）基因功能互補(bǔ)法和基因文庫(kù)篩選法，從NEAU-ST10-40T中克隆得到1個(gè)能夠使大腸桿菌(E.co li)KNabc在0.3MNaCl的LBK培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的重組子。此重組子在M13F方向的序列分析顯示，該重組子包含的外源基因片段長(zhǎng)4442 bp，

3、該片段含有4個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1-4)以及各自的SD序列和推測(cè)的啟動(dòng)子序列。其中有3個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF2-4)，ORF3和ORF4共用一個(gè)終止子序列。不完整的ORF1有推測(cè)的啟動(dòng)子序列但無(wú)終止子序列。其中，被截短的ORF1(M13R，2-788 bp)長(zhǎng)789 bp，ORF1與Halobacillus trueperi中的一個(gè)推測(cè)的甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(putative glycine betaine transporter，

4、BCCT superfamily)同源性最高(82％)，其基因被命名為甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)體，但該序列不完整。ORF2(1985-2351 bp)長(zhǎng)369 bp，ORF2與芽孢桿菌（Bacillaceae）中的一個(gè)推測(cè)的假定蛋白(hypothetical protein，YugN superfamily)同源性最高(73％)，其基因被命名為yugN。ORF3(2457-3513 bp)長(zhǎng)1059 bp，ORF3與Halobacillus kuro

5、shimensis中一個(gè)推測(cè)的未知功能的UPF0118 family protein，UPF0118superfamily)同源性最高(81.5％)，其基因被命名為upf0118。ORF4(3551-4096 bp，M13R)長(zhǎng)548 bp。ORF4與Halobacillussp.BBL2006中一個(gè)推測(cè)的GNAT家族乙酰轉(zhuǎn)移酶(GNATfamily acetyltransferase，NAT_SF superfamily)同源性最高(

6、63％)，其基因被命名為GNAT家族乙酰轉(zhuǎn)移酶。通過(guò)基因亞克隆，發(fā)現(xiàn)upf0118基因能夠與大腸桿菌(E.coli) KNabc發(fā)生互補(bǔ)，使其在0.3 M NaCl、30 mM LiCl以及堿性pH8.0條件下生長(zhǎng)并與重組子幾乎一致。同時(shí)，利用軟件對(duì)UPF0118的氨基酸殘基組成和拓?fù)鋵W(xué)分析顯示，此蛋白由352個(gè)氨基酸殘基組成，具有6個(gè)跨膜區(qū)，其中有225個(gè)殘基是疏水性氨基酸，從而說(shuō)明UPF0118是低極性的。用DNAMAN6.0預(yù)測(cè)其

7、分子量為39，611.01Dalton，等電點(diǎn)pI為9.76。這初步判斷UPF0118蛋白可能具有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性且為一個(gè)膜蛋白。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，UPF0118與其家族中的同源物單獨(dú)成簇，而與所有已知的單基因Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和具有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的單基因蛋白距離較遠(yuǎn)。蛋白同源性比對(duì)顯示，UPF0118與來(lái)自于H.kuroshimensis中同源物的相似性最高為81.5％，其次為來(lái)自Halkaliphi

8、lus(accession.version No.SFF94744.1),H.halophilus(accession.version No.WP_014643083.1),H.dabanensis(accession.version No.WP_075036522.1),H.karajensis(accession.version No.SEH70700.1)，Virgibacillus sp.SK-1(accession.versi

9、on No.WP_053219791.1),Sediminibacillus albus(accession.version No.SDJ74814.1)，Thalassobacillus cyri(accession.version No.SEB17075.1),Pontibacillus chungwhensis(accession.versionNo.WP_036781630.1)and P.marinus（accession.v