Smad核互作蛋白在克氏原螯蝦蛻皮激素信號(hào)通路中的功能.pdf

1、蛻皮激素在蝦蟹類動(dòng)物的性別分化、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，然而其分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。開展蛻皮激素信號(hào)途徑的研究，對(duì)于闡明甲殼類動(dòng)物的蛻皮機(jī)制，促進(jìn)蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。SNIP1（Smad nuclear interacting protein）是一個(gè)與Smad相互作用并含有多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，具有特異性的DNA結(jié)合活性，參與了多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控。克氏原螯蝦,也稱小龍蝦，因肉味鮮美廣受人們歡迎，近年來已經(jīng)成為重要的水

2、產(chǎn)養(yǎng)殖品種。本研究旨在探討 SNIP1在克氏原螯蝦蛻皮激素信號(hào)通路中的功能，取得的主要結(jié)果如下：
　　1、本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有部分序列，設(shè)計(jì)特異性引物克隆了克氏原螯蝦 Smad核互作蛋白1（SNIP1）基因的開放式閱讀框序列（ORF，open reading frame），生物信息學(xué)分析表明SNIP1基因的開放式閱讀框序列全長(zhǎng)為867bp，編碼的蛋白質(zhì)含有288個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的成熟蛋白理論分子量分子量為34.9KDa，其等電點(diǎn)為6.

3、18。其蛋白質(zhì)C末端具有高度保守的FHA結(jié)構(gòu)域，而其N端具有一段核定位序列,進(jìn)化樹分析表明克氏原螯蝦SNIP1基因與無脊椎動(dòng)物SNIP1基因親緣關(guān)系最近。
　　2、通過雙酶切法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-Pc-SNIP1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。轉(zhuǎn)化至 E. coli Rosetta(DE3)，用不同濃度 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳和 Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明克氏原螯蝦SNIP1融

4、合蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，重組蛋白分子量大小為35KDa左右。通過Ni柱親和層析柱純化重組蛋白，使用純化的蛋白制備多克隆抗體，獲得的抗體的效價(jià)為1：9000。
　　3、提取克氏原螯蝦肝胰腺、腸、肌肉、鰓、心臟、胃6個(gè)不同組織的總蛋白和總RNA，通過免疫印跡法和熒光定量PCR法分析克氏原螯蝦在不同組織中的表達(dá)分布情況。結(jié)果表克氏原螯蝦SNIP1基因在心臟中的表達(dá)量最高。
　　4、注射蛻皮激素后克氏原螯蝦肝胰腺中SNI