PP-rhBMP-4m的表達、純化和活性.pdf

1、用基因工程手段制備蛋白質(zhì)最常用的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，它有融合表達和非融合表達兩種形式。將編碼目的蛋白的基因與表達載體上能夠高表達已知蛋白質(zhì)或多肽的基因融合，是融合表達形式。這種表達形式有很多優(yōu)點： 首先是容易做到目的蛋白的高表達；其次融合的蛋白質(zhì)或多肽的親水性或分子伴侶性質(zhì)能使表達的融合蛋白易于溶解或復性；融合表達可以帶有各種標簽，便于純化和鑒定等。因而融合表達成為研究蛋白質(zhì)功能、研制基因工程蛋白質(zhì)藥物的常用手段。各生物技術(shù)公司

2、構(gòu)建的多種商售蛋白質(zhì)融合表達載體也已經(jīng)被廣泛應用。但目前所用的融合表達載體有共同的缺點：帶在目的蛋白上的標簽蛋白不易被去除，融合的標簽蛋白會在體內(nèi)引起不必要的免疫反應或影響目的蛋白的活性和正常行徑等。常用的酶學方法來切除標簽，不僅費用昂貴，且效率不高，目的蛋白的回收率低。已知的化學裂解方法，如溴化氰法等，因其劇毒等原因又很少使用。 骨形成蛋白4（BMP-4）是骨形成蛋白家族的一員，人骨形成蛋白4 成熟肽（hBMP-4m）由l16

3、 個氨基酸組成。BMP-4 具有多種生理功能，除了誘導骨組織的形成外，對造血組織的形成具有重要的誘導分化作用，對三系血細胞都有促進生長的作用，這種作用較其它BMP 持久，是一種長時間促進血細胞生長的因子。制備BMP-4 也面臨一個選擇合適的表達系統(tǒng)的問題。 用真核細胞表達，可以直接獲得有活性的BMP-4，但其產(chǎn)量低，價格昂貴，只適用于實驗室研究，難以大規(guī)模生產(chǎn)，制約了其臨床應用。使用大腸桿菌系統(tǒng)其表達蛋白量大，生產(chǎn)純化工藝較簡單

4、，不失為一種選擇。本室曾克隆得hBMP-4m 的cDNA 編碼序列，克隆入pDH2 載體，在大腸桿菌中進行非融合表達并純化制備（已獲得國家發(fā)明專利），但純化步驟復雜，蛋白損失量大，收得率低。 本文用hBMP-4m 作為靶基因，構(gòu)建了一種大腸桿菌甲酸水解融合蛋白表達系統(tǒng)。用此系統(tǒng)不僅能高效表達目的蛋白、還能減少表達產(chǎn)物的純化步驟，并且獲得的蛋白具有與非融合表達的hBMP-4m 相似的生物學功能。該系統(tǒng)也可用于其他蛋白的表達。

5、 一、原核甲酸水解融合表達載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建能高效表達目的蛋白的甲酸水解融合表達載體。 方法：用PCR方法分別在hBMP-4m 基因的5’端加上編碼Asp-Pro-Pro 酸水解肽的不同簡并碼序列，克隆入原核融合表達載體pRSET-B 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 后進行誘導表達，SDS－PAGE 分析，觀察融合蛋白的表達效果。 結(jié)果：成功構(gòu)建9個不同簡并碼序列的酸水解肽融合表達載體，分別命名為pRSET-DP

6、P-rhBMP4m 1~9；經(jīng)誘導表達分析，只有在兩個脯氨酸的密碼子均為CCG 時，融合蛋白才能高效表達，表達量達到細菌總蛋白量的38.4％。 結(jié)論：改變表達肽鏈中段氨基酸密碼子的堿基序列可以顯著影響融合蛋白的表達效果。 二、甲酸水解融合表達載體的應用 目的：利用已構(gòu)建好的甲酸水解融合表達載體系統(tǒng)大量表達并純化PP-rhBMP-4m。 方法：用可高效表達的pRSET-DPP-rhBMP-4m 系統(tǒng)進行大規(guī)

7、模發(fā)酵，包涵體洗滌后，溶解于8M 尿素變性液；利用鎳離子親和層析柱直接純化融合蛋白，用甲酸裂解去除6×His-D 標簽肽段；SDS-PAGE 分析目的蛋白，并進行蛋白含量測定，計算目的蛋白得率。 結(jié)果：經(jīng)發(fā)酵、裂菌、洗滌等操作，融合蛋白純度達到57％以上；經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后，目的蛋白純度為98％；目的蛋白得率為69.8％；甲酸裂解效率達到93％以上。 結(jié)論：我們構(gòu)建的pRSET-DPP-rhBMP-4m 是一種可以

8、有效去除融合標簽，純化目的蛋白的融合表達系統(tǒng)。 三、PP-rhBMP-4m 細胞活性檢測 目的：檢測氨基端帶有兩個脯氨酸的目的蛋白PP-rhBMP-4m 與非融合表達的目的蛋白rhBMP-4m 的生物學活性是否相當。 方法：分別用PP-rhBMP-4m 和rhBMP-4m 刺激骨髓基質(zhì)細胞和帶有熒光素酶報告基因的C2C12K5 及NIH3T3K2 細胞（國家發(fā)明專利號：ZL 01 1 31813.9）；MTT 法

9、檢測骨髓基質(zhì)細胞增殖情況；檢測用藥前后骨髓基質(zhì)細胞ALP 表達量的變化；檢測用藥前后C2C12K5 及NIH3T3K2 細胞熒光素酶活性的變化。 結(jié)果：兩種蛋白均可促進骨髓基質(zhì)細胞的增殖，并且ALP 值均有增高，兩組間無顯著性差異（p>0.05）；熒光素酶活性分析顯示，不管是C2C12K5 還是NIH3T3K2都在被PP-rhBM-4m或rhBMP-4m刺激后熒光素酶活性有所增強，兩種刺激因子無顯著性差異（p>0.05）。

10、 結(jié)論：PP-rhBMP-4m、rhBMP-4m 在細胞活性方面沒有差異。我們在設計大腸桿菌融合表達載體時，利用甲酸水解位點（Asp-Pro）的同時，也利用了哺乳動物體內(nèi)普遍存在的脯氨酰肽酶（Prolyl peptidases）能夠切除肽鏈氨基端第二個氨基酸殘基為Pro 的特點，設計了Asp-Pro-Pro三肽序列。用它連接標簽蛋白和目的蛋白，即形成“標簽蛋白－Asp-Pro-Pro－目的蛋白”的結(jié)構(gòu)。在得到這樣的肽鏈之后，首先可以利

11、用甲酸水解去除標簽蛋白，然后將氨基端帶有兩個脯氨酸（Pro-Pro）的目的蛋白放入動物體內(nèi)，利用哺乳動物體內(nèi)的脯氨酰肽酶將兩個脯氨酸去除，最終使目的蛋白在體內(nèi)發(fā)揮生物學效應。另外，我們構(gòu)建的這種甲酸水解融合表達載體可用于多種蛋白質(zhì)的表達和純化，尤其適合于小分子肽的表達。因為融合蛋白能增加表達小分子肽的穩(wěn)定性；Asp-Pro-Pro 這個結(jié)構(gòu)又可以用于小分子肽之間的連接，構(gòu)建小分子肽串聯(lián)體，這樣既可以克服小分子肽不易表達，不易檢測等缺點，