兩種海參多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究.pdf

1、海地瓜（Acaudina molpadioides）和黑乳參（Holothuria nobilis）分別被歸屬為海參綱（Holothuroidea）芋參目尻參科和海參綱楯手目海參科，資源十分豐富，從我國山東省到海南島各海域均有分布，但其市場價格遠遠低于刺參（Stichopusjaponicus），尚未得到全面的開發(fā)與利用。海參的主要活性成分為多糖，其中巖藻糖基化的硫酸軟骨素（Fucosylated chondroitin sulfate

2、，F(xiàn)ucCS）是海參體壁中非常重要的一種活性雜多糖，不同海參品種中的FucCS具有不同的結(jié)構(gòu)和活性。國內(nèi)外對海參多糖研究的比較多，但對這兩種海參的FucCS研究較少，且沒有做過比較分析;尤其是對這兩種海參FucCS寡糖的研究尚未開展。為探索這兩種低值海參多糖的生物學(xué)活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，本文分別對采自江蘇省連云港的海地瓜和黑乳參體壁的營養(yǎng)成分、巖藻糖基化硫酸軟骨素的分離純化、FucCS一級結(jié)構(gòu)及其體外抗凝血和抗腫瘤活性進行了研究。主要結(jié)果如

3、下:
　　1.海地瓜和黑乳參體壁的營養(yǎng)成分
　　對兩種海參體壁的體成分，氨基酸，脂肪酸，礦物質(zhì)和微量元素的組成分別進行分析和比較。結(jié)果表明，海地瓜和黑乳參的體壁組成具有相同的特點:高蛋白，低脂肪。海地瓜和黑乳參的蛋白含量分別為干重的80.22％和70.81％，粗脂肪含量分別為干重的0.50％和1.33％。但兩種海參的脂肪酸種類差異比較大，兩者比較得出，海地瓜中含有更多的不飽和脂肪酸和更少的飽和脂肪酸。兩種海參的氨基酸分布和組

4、成都比較均衡，且一半以上為鮮味氨基酸，這賦予了其鮮美的口味。同時，兩種海參都含有較高含量的Fe（16.25-21.55 mg/kg）和Zn(12.45-18.95 mg/kg)。
　　2.FucCS的分離純化和理化性質(zhì)
　　經(jīng)過初步的提取分離，從海地瓜和黑乳參中獲得了混合的多糖，其粗多糖的產(chǎn)率分別為7.60％和8.29％。粗多糖經(jīng)過陰離子交換層析柱DEAE-Sepharose FastFlow和分子篩凝膠過濾層析柱Sepha

5、dex G-100的分離與純化后，分別獲得兩個較純的FucCS類多糖ACP（來自海地瓜）和HOP（來自黑乳參），其產(chǎn)率分別是粗多糖的32.56％和35.22％。其純度經(jīng)過醋酸纖維素薄膜電泳鑒定為一條單一的條帶;通過高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測得其分子量分別為ACP94.707kDa和HOP136.238 kDa。
　　3.FucCS一級結(jié)構(gòu)的鑒定
　　利用化學(xué)法和PMP柱前衍生化-HPLC結(jié)合法來測定FucCS的單糖組

6、成，采用氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸基團的含量。結(jié)果表明，ACP和HOP是由葡萄糖醛酸(GlcUA)、半乳糖胺(GalNAc)、巖藻糖(Fuc)和硫酸基團（sulfate）組成，GlcUA與GalNAc的摩爾比約為1∶0.80; HOP硫酸基團的含量遠高于ACP，以1摩爾的Fuc作參照，ACP中硫酸基團的含量為2.64，HOP為4.30。利用(-)-2-丁醇，通過裝有毛細管柱SE-30的GC分析可以確定ACP和HOP中各單糖的絕對構(gòu)型為D

7、-GlcUA，D-GalNAc和L-Fuc。
　　通過傅里葉紅外光譜法(FT-IR)可獲得多糖結(jié)構(gòu)上的很多信息，特別是在指紋識別區(qū)1，253 cm-1的頻帶被歸屬為S=O的反對稱伸縮振動;820/852/853 cm-1的頻帶可以歸屬為C-O-S的對稱伸縮振動;584 cm-1的頻帶被歸屬為S-O伸縮振動，這些都可以證明硫酸基團的存在。然而，HOP的FT-IR譜圖中只有852 cm-1的頻帶，說明HOP分子中缺少一些其它類型的硫酸

8、基團。同時，820/852/853 cm-1處的頻帶也說明了α型吡喃糖苷鍵的存在。
　　甲基化分析可以確定多糖中各單糖殘基的連接方式。經(jīng)過還原和脫硫反應(yīng)的ACP與HOP，經(jīng)過甲基化，衍生化后生成部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA)，進行GC-MS分析。結(jié)果表明ACP和HOP中主要含有1，4-Linked-GalNAc，1，3，4-Linked-GlcUA，1-Linked-Fuc，并且其比例與單糖組成分析的結(jié)果基本一致;另外還含有少

9、量的1-Linked-Gal，1，4-Linked-GlcUA。
　　NMR譜圖進一步提供了更多關(guān)于結(jié)構(gòu)方面的詳細信息。在1H NMR譜圖中，5.0-5.8 ppm的化學(xué)位移是異頭質(zhì)子信號區(qū)，說明了α型硫酸巖藻糖殘基的存在，并且ACP和HOP在該區(qū)的信號峰明顯不同，表明其巖藻糖殘基具有不同硫酸基取代類型。通過對比和積分后得出，ACP中的硫酸基團取代類型為Fuc2，4S，F(xiàn)uc3，4S，F(xiàn)uc4S和Fuc0S，比例分別為0.16∶0

10、.16∶0.08∶0.27; HOP中的硫酸基團取代類型為Fuc2,4S，F(xiàn)uc3S和Fuc0S，比例分別為0.08∶0.24∶0.36。二維1H-1H相關(guān)譜(COSY)也進一步確認和證實了這種歸屬。13C NMR譜圖進一步給出了多糖的骨架組成方式，且ACP和HOP的13C NMR譜中觀察到的碳骨架信號是非常相似的，都是由L-Fuc，D-GalNAc和D-GlcUA組成，這與單糖組成分析的結(jié)果相吻合。根據(jù)H1/H2的耦合常數(shù)分別是6.5

11、與7.4 Hz可知，D-GalNAc和D-GlcUA的異頭碳構(gòu)型為β。寡糖o-ACP和o-HOP的二維核磁共振譜HSQC和HMBC也進一步確認了這些歸屬。
　　4.FucCS的體外抗凝血和抗腫瘤活性
　　通過測量活化的凝血酶時間(APTT)，凝血酶原時間(PT)，凝血酶時間(TT)，纖維蛋白原濃度(FBG)等指標，對ACP和HOP的體外抗凝血活性進行了檢測。結(jié)果表明，ACP和HOP都可以顯著地延長凝血時間，具有明顯的抗凝活性

12、，在0-60μg/mL范圍內(nèi)與濃度成正比;ACP和HOP的抗凝血效果要比肝素(150 IU/mg)好，且HOP的抗凝效果要優(yōu)于ACP。
　　以3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法探討了ACP和HOP對人宮頸癌Hela細胞、人肝癌細胞Hep G2、人胃癌細胞SGC-7901和人白血病細胞HL60生長的體外抑制作用。ACP和HOP都對Hela細胞、SGC-7901細胞和HL60細胞有中效抑制作用，都對H