簡(jiǎn)介：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性腫瘤的第二位，是全球最主要的癌癥之一。流行病學(xué)顯示，持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒HUMANPAPILLOMAVIRUS，HPV是宮頸癌最重要的致病因素。約95％宮頸癌活組織檢查均檢測(cè)出有HPV的感染，證實(shí)了人乳頭瘤病毒HPV感染與宮頸癌密切相關(guān)。大約有50和20的宮頸癌病例分別檢測(cè)出高危型的HPV16和18，這兩種基因型的HPV在宮頸癌中的感染率最高。因此，大多數(shù)研究主要是集中在HPV16和18的生物學(xué)研究上。在目前HPV治療性疫苗沒(méi)有取得突破性的進(jìn)展，預(yù)防性疫苗僅適用于部分人群的情況下，治療性藥物的研究和開(kāi)發(fā)仍然顯得很重要。而在藥物研發(fā)的最初階段，關(guān)鍵在于能否建立穩(wěn)定，快速，有效的藥物篩選模型并加以應(yīng)用。本課題主要研究的目的是建立抗HPV16藥物的篩選模型，用于抗HPV16藥物的發(fā)現(xiàn)。采用HPV16陽(yáng)性細(xì)胞CASKI，以HPV16E6，E7基因?yàn)榘悬c(diǎn)，ΒACTIN為內(nèi)參基因，提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成CDNA，再以CDNA為模板進(jìn)行REALTIMEPCR，通過(guò)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，最終確定PCR反應(yīng)條件和特異性E6，E7，ΒACTIN引物，建立篩選抗HPV16候選物的REALTIMEPCR方法。以抗病毒藥物西多福韋CDV作為CASKI細(xì)胞模型的陽(yáng)性對(duì)照藥物。CDV處理CASKI細(xì)胞48H后提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，通過(guò)REALTIMEPCR檢測(cè)E6，E7在基因水平上的變化。CDV對(duì)CASKI細(xì)胞HPV16E6MRNA表達(dá)的抑制呈劑量依賴(lài)效應(yīng)，125ΜGML和4167ΜGML的CDV對(duì)CASKI細(xì)胞HPV16E6MRNA抑制率分別為5410和5027，對(duì)E7MRNA抑制率分別為4797和5275。通過(guò)CASKI細(xì)胞模型對(duì)50余個(gè)化合物和化學(xué)復(fù)方制劑進(jìn)行篩選，得到了具有抗HPV16活性的陽(yáng)性化合物L(fēng)905122。受試化合物L(fēng)905122處理CASKI細(xì)胞48H后，提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，最后進(jìn)行REALTIMEPCR。化合物L(fēng)905122對(duì)CASKI細(xì)胞HPV16E6MRNA表達(dá)的抑制呈劑量依賴(lài)效應(yīng)，濃度為40ΜGML的L905122對(duì)CASKI細(xì)胞HPV16E6和E7MRNA的表達(dá)有下調(diào)作用，抑制率分別為726和7706。WESTERNBLOTTING的結(jié)果顯示濃度為40ΜGML的L905122對(duì)CASKI細(xì)胞HPV16E6蛋白表達(dá)有下調(diào)作用，抑制率達(dá)71。并且濃度為40ΜGML，20ΜGML，10ΜGML5ΜGML的L905122對(duì)CASKI細(xì)胞HPV16E7蛋白的表達(dá)均有下調(diào)作用，抑制率分別為82，81，77，66。另外初步探討了化合物L(fēng)905122對(duì)腫瘤抑制因子P53和PRB蛋白的影響。40ΜGML的L905122能夠提高CASKI細(xì)胞內(nèi)的P53和PRB蛋白的表達(dá)?；衔風(fēng)905122僅僅是通過(guò)降低E6，E7蛋白水平從而間接提高細(xì)胞內(nèi)的P53和PRB蛋白水平或者是還通過(guò)其他機(jī)制來(lái)提高P53和PRB蛋白的表達(dá)，還需進(jìn)一步的深入研究。采用含HPV16病毒結(jié)構(gòu)蛋白L1和L2基因的表達(dá)質(zhì)粒和含GFP基因的報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T17細(xì)胞的方法成功制備了HPV16假病毒，并且建立了HPV16假病毒的細(xì)胞感染模型。將HPV16假病毒細(xì)胞感染模型作為篩選模型，得到了具有抗HPV16活性的復(fù)方高效碘，熒光檢測(cè)結(jié)果和WESTERNBLOTTING結(jié)果均顯示復(fù)方高效碘在濃度為124原液時(shí)有較好的抑制病毒入胞的作用。初步建立了以GFP為報(bào)告基因的HPV16假病毒小鼠模型，并且采用該模型對(duì)復(fù)方高效碘的乳膏劑抗HPV16作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示其具有抑制HPV16感染小鼠陰道上皮細(xì)胞的作用。但由于存在較大的背景熒光，今后還應(yīng)對(duì)假病毒小鼠模型的試驗(yàn)條件進(jìn)一步優(yōu)化，提高其實(shí)用性。宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第二位，已證持續(xù)性感染實(shí)高危型人乳頭瘤病毒HPV是誘發(fā)宮頸癌的主要因素，約95宮頸癌活組織檢查均檢測(cè)出有HPV的感染。HPV病毒的早期蛋白E6和E7在高危型HPV引起宮頸癌起著關(guān)鍵的作用，這兩種蛋白可以通過(guò)不同的機(jī)制逃避宿主的免疫系統(tǒng)，改變細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞DNA的損傷和突變，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。本文從HPV與宮頸癌關(guān)系，HPV病毒生活周期和致病機(jī)理，HPV病毒研究模型，抗HPV藥物和疫苗的研究成果等方面作一綜述。

簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)蘭鯊三UDC碩士學(xué)位論文密級(jí)編號(hào)豬星狀病毒分離鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研究蘭家暖學(xué)科專(zhuān)業(yè)亟隨獸醫(yī)堂指導(dǎo)教師黃焦堅(jiān)數(shù)援一論文答辯日期2Q生旦曼Q旦學(xué)位授予日期2Q生魚(yú)且答辯委員會(huì)主席矍廷苤教攫論文評(píng)閱人隆淫搓嬰究員趙武巫究員豬星狀病毒分離鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研究摘要星狀病毒ASTROVIRUS，ASTV屬于人獸共患病病原，與多種動(dòng)物的腹瀉性疾病有關(guān)，目前廣泛分布于世界各地。星狀病毒常同冠狀病毒、輪狀病毒、嵌杯狀病毒及其它腸道病毒混合感染造成急性胃腸炎，尤其對(duì)小孩及幼畜危害最大。本研究對(duì)豬星狀病毒進(jìn)行分離鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)特性研究，將為今后預(yù)防豬星狀病毒感染和傳播提供實(shí)驗(yàn)方法和手段。通過(guò)對(duì)廣西某豬場(chǎng)經(jīng)RTNPCR檢測(cè)呈豬星狀病毒陽(yáng)性的糞樣進(jìn)行病毒分離，獲得兩株能在PK15細(xì)胞上增殖，并能使該細(xì)胞變大、胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒，最后細(xì)胞破碎、脫落等細(xì)胞病變的病毒；在電鏡下觀察，該病毒呈典型的星狀結(jié)構(gòu)，直徑約28一35NM；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，攻毒豬出現(xiàn)溫和性腹瀉，體重減輕，腸系膜淋巴結(jié)腫大和腸絨毛變短等臨床癥狀和在絨毛上皮細(xì)胞層及絨毛腔有大量淋巴細(xì)胞及少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。病毒的成功分離，為豬星狀病毒分子生物學(xué)以及致病機(jī)制的研究提供材料。應(yīng)用RTNPCR方法，對(duì)采自廣西7個(gè)市縣27個(gè)不同規(guī)模化豬場(chǎng)和廣東湛江2個(gè)不同規(guī)?；i場(chǎng)共315份豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)828％24／29；樣品陽(yáng)性率達(dá)403％127／315；030日齡的小豬感染率最高，達(dá)449％53／118；春季24月感染率最高，為543％38／70。調(diào)查結(jié)果表明，豬群中普遍存在豬星狀病毒感染。另外，L

簡(jiǎn)介：背景與目的輪狀病毒ROTAVIRUS，RV是引起嬰幼兒秋冬季腹瀉的最重要病原體，全球每年約有1億嬰幼兒感染RV，其中近50萬(wàn)感染者重癥死亡。迄今為止依據(jù)RV的VP6特性，發(fā)現(xiàn)的輪狀病毒共7個(gè)組A～G，其中感染嬰幼兒的主要為A組輪狀病毒。RV的感染與經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生條件的差異不明顯，全球各國(guó)均有發(fā)生，發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家感染率相似，病死率發(fā)展中國(guó)家較高。RV的感染給人類(lèi)帶來(lái)沉重的疾病傷害和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前尚無(wú)治療輪狀病毒有效藥物，研制疫苗是預(yù)防和控制RV感染、降低死亡率有效途徑。世界衛(wèi)生組織WLDHEALTHGANIZATION，WHO也積極推動(dòng)各國(guó)政府進(jìn)行輪狀病毒疫苗的研究與開(kāi)發(fā)。目前上市的有ROTARIX基因型為G1P8、ROTATEQ基因型為G1，G2，G3，G4，G6和P8和羅特威基因型為G10P12三種減毒疫苗。這三種減毒疫苗在預(yù)防RV感染起到重要作用。減毒疫苗本身也存在一定共性問(wèn)題，例如可能發(fā)生毒力返祖疫苗制備過(guò)程中的外源因子污染，預(yù)存抗體對(duì)疫苗有效性的影響不能用于免疫缺陷或者免疫抑制治療人群等。因此，開(kāi)發(fā)其他形式的輪狀病毒疫苗是一種新的思路，包括滅活疫苗和亞單位疫苗等。無(wú)論研制何種形式的疫苗，研究疾病的流行病學(xué)動(dòng)態(tài)和病原體特征都是非常重要的。自20世紀(jì)70年代RV被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，A組輪狀病毒依據(jù)病毒VP7糖蛋白抗原G型特性至少有14個(gè)型，VP4蛋白水解酶P型特性至少有19個(gè)型，基因型與血清型基本一致。流行病學(xué)研究表明，在不同地區(qū)和不同時(shí)間造成RV流行病毒株基因型是不同的。例如最初流行主要毒株型為G1型，隨后出現(xiàn)G3和G2等病毒株的流行。最近在中國(guó)多個(gè)地區(qū)的流行病學(xué)資料提示，G9型已經(jīng)逐漸成為主要流行型。雖然有關(guān)RV病毒的研究表明，不同型之間有交叉識(shí)別和一定水平的交叉保護(hù)作用，但不同型的交叉保護(hù)能力存在顯著性差異。一般而言，同型的保護(hù)效力最高。因此，選擇目前或者未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)主要流行毒株作為疫苗研制的材料，開(kāi)展RV滅活疫苗的相關(guān)基礎(chǔ)研究具有重要意義。方法1通過(guò)主題詞“輪狀病毒”和“ROTAVIRUS”分別在中國(guó)知網(wǎng)CNKI和PUBMED對(duì)2003～2013年進(jìn)行文獻(xiàn)回顧性檢索，并對(duì)采集到的文獻(xiàn)進(jìn)行流行病學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)分析2用醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子生物學(xué)研究室分離的ZTR18G9型野生RV毒株，經(jīng)羅猴胚胎腎傳代細(xì)胞MA104細(xì)胞傳代至第9代，然后進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)制備病毒液3經(jīng)PAGE檢測(cè)基因組電泳條帶型及穩(wěn)定性4用RTPCR測(cè)序檢測(cè)VP7基因型5用免疫熒光法FFA測(cè)定病毒感染性滴度6通過(guò)超濾和QFF、G25層析等步驟純化病毒7用終濃度為000925％甲醛，進(jìn)行72小時(shí)37℃滅活8經(jīng)細(xì)胞病變和熒光灶法檢測(cè)殘余活病毒9ELISA測(cè)定疫苗制備過(guò)程中病毒抗原含量酶標(biāo)單位EU10用LOWRY法測(cè)定超濾液和疫苗滅活后蛋白質(zhì)含量變化11用負(fù)染法電鏡觀察滅活前后RV形態(tài)變化12選擇SPF級(jí)ICR雄性小鼠，按不同免疫劑量從320EU起始，倍比遞減，共分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)PBS對(duì)照組，每組六只，肌肉注射，共免疫兩次，每次間隔14天13用ZTR18G9型滅活疫苗和ZTR68G1型滅活疫苗，進(jìn)行雙價(jià)滅活疫苗評(píng)價(jià)，雙價(jià)疫苗中兩種單價(jià)滅活疫苗均為160EU，采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及免疫程序同1214經(jīng)ELISA分析兩種單價(jià)滅活疫苗和雙價(jià)滅活疫苗免疫小鼠后血清抗體反應(yīng)15用熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)FFIT檢測(cè)三種疫苗誘導(dǎo)的血清抗體對(duì)ZTR68G1型、WAG1型、S2G2型、SA11G3型、GOTTFRIEDG4型和ZTR18G9型中和效價(jià)。結(jié)果1感染陽(yáng)性病例數(shù)前三省份為廣東186587例，浙江133390例和湖北11104例2感染陽(yáng)性率最多的前三省份是河南7520％、吉林6494％和寧夏回族自治區(qū)6016％3G型最多的三個(gè)是G38509例、G16490例和G21601例4G型中G9型RV最近幾年呈現(xiàn)病例數(shù)快速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)5P型最多的前三個(gè)是P88483例、P42017例和P6740例6在中國(guó)治療主要采用的是疫苗預(yù)防結(jié)合臨床對(duì)癥治療的方式7PAGE證明病毒傳代過(guò)程中基因組條帶與原始株相同8RTPCR測(cè)序及序列比對(duì)證實(shí)病毒傳代過(guò)程VP7基因未發(fā)生變異9FFA法測(cè)定病毒滴度為10517CCID50ML10ELLSA檢測(cè)經(jīng)超濾，純化，滅活后疫苗的抗原含量為1600EUML11LOWRY法測(cè)定，病毒收獲液超濾，純化，滅活蛋白質(zhì)含量從收獲液的08MGML降為滅活的016MGML12負(fù)染法觀察滅活前后RV形態(tài)，均可見(jiàn)完整的病毒顆粒13動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZTR18G9型滅活疫苗以160EU100ΜL為最佳免疫劑量。14ELISA測(cè)得雙價(jià)滅活疫苗免疫小鼠的血清ELISA效價(jià)比ZTR68G1型和ZTR18G9型兩個(gè)單價(jià)滅活疫苗的效價(jià)高15同型和交叉中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙價(jià)輪狀病毒滅活疫苗及兩種單價(jià)滅活疫苗免疫小鼠的血清與ZTR68G1型、WAG1型、S2G2型、SA11G3型、GOTTFRIEDG4型和ZTR18G9型六個(gè)RV血清型均有一定交叉中和作用。結(jié)論1流行病學(xué)研究的提示，G9型RV可能會(huì)成為未來(lái)RV主要流行型。2用目前的制備方法可獲得具有良好免疫原性的實(shí)驗(yàn)性疫苗3雙價(jià)滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的ELISA抗體效價(jià)要比單價(jià)高5抗ZTR68G1型和ZTR18G9型抗體可中和ZTR68G1型、WAG1型、S2G2型、SA11G3型、GOTTFRIEDG4型和ZTR18G9型六種血清型RV，但中和程度效價(jià)在不同型間存在一定差異，同型中和效價(jià)高于異型。

簡(jiǎn)介：根據(jù)2006年全國(guó)范圍內(nèi)的血清流行病學(xué)調(diào)查資料，我國(guó)1～59歲人群中乙型肝炎表面抗原（HEPATITISBSURFACEANTIGEN，HBSAG）攜帶率已從1992年的975降至718，盡管HBSAG攜帶率降到8以下，但由于我國(guó)人口基數(shù)龐大，按目前HBSAG攜帶率推算，我國(guó)仍然有HBSAG攜帶者約9300萬(wàn)人，約占全世界慢性HBV感染者的14。其中慢性乙型肝炎（CHRONICHEPATITISB，CHB）約為2000萬(wàn)～3000萬(wàn)例，全國(guó)每年死于乙肝相關(guān)肝病約30余萬(wàn)例。所以對(duì)慢性HBV感染者特別是對(duì)處于非活動(dòng)性HBSAG攜帶者（INACTIVEHBSAGCARRIER，HBSAGIAC）狀態(tài)的感染者的管理是一項(xiàng)重要而艱巨的任務(wù)。HBV感染者可以打破免疫耐受清除乙型肝炎病毒E抗原（HEPATITISBEANTIGEN，HBEAG），產(chǎn)生乙型肝炎病毒E抗體（HEPATITISBEANTIBODY，ANTIHBE），即發(fā)生HBEAG血清學(xué)轉(zhuǎn)換，發(fā)生HBEAG血清學(xué)轉(zhuǎn)換的群體中有67?的人可以保持低水平的HBVDNA或HBVDNA檢測(cè)不到、ALT水平正常和輕度或不伴有肝組織壞死性炎癥的狀態(tài)，這種被狀態(tài)定義為HBSAGIAC狀態(tài)。HBSAGIAC狀態(tài)可以是自發(fā)病情緩解而達(dá)到，也可以是核苷（酸）類(lèi)似物（NA）或Α干擾素抗病毒治療達(dá)到完全應(yīng)答后病情得以緩解和穩(wěn)定而達(dá)到，不管HBSAGIAC狀態(tài)經(jīng)歷何種過(guò)程預(yù)后通常較好，是HBV感染者比較理想的維持狀態(tài)。然而，即使長(zhǎng)期保持穩(wěn)定攜帶狀態(tài)，由于肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（COVALENTLYCLOSEDCIRCULARDNA，CCCDNA）很難被徹底清除，所以當(dāng)機(jī)體處于免疫虛損或免疫抑制狀態(tài)時(shí)或在病毒變異的情況下，病毒就會(huì)重新活動(dòng)、復(fù)制，肝組織內(nèi)再次出現(xiàn)炎癥活動(dòng)。曾有研究報(bào)道超過(guò)20的HBSAGIACS進(jìn)展為HBEAG陰性CHBHBEAGNEGATIVECHRONICHEPATITISB，HBEAG（）CHB，而后者存在肝臟疾病反復(fù)活動(dòng)、進(jìn)展、發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，約有23和4的HBEAG（）CHB分別進(jìn)展為肝硬化和肝癌。為了阻止HBSAGIACS向HBEAG（）CHB發(fā)展的進(jìn)程，首先弄清HBSAGIACS和HBEAG（）CHB宿主和病毒學(xué)特征有無(wú)差異是很重要的。利用NA對(duì)HBEAG陽(yáng)性慢性乙型肝炎HBEAGPOSITIVECHRONICHEPATITISB，HBEAG（）CHB進(jìn)行抗病毒治療，在藥物和機(jī)體免疫力的共同作用下HBV水平逐漸降低、HBEAG逐漸被清除，其中有相當(dāng)一部分人可以達(dá)到HBSAGIAC狀態(tài)，HBEAG（）CHB經(jīng)NA治療達(dá)到完全應(yīng)答的患者（NCRECHB）可以實(shí)現(xiàn)并藥物維持HBSAGIAC狀態(tài)，與自發(fā)形成HBSAGIAC狀態(tài)的過(guò)程不同，為了發(fā)現(xiàn)NA抗病毒治療的療效與宿主和病毒的關(guān)系，認(rèn)識(shí)兩組人群的基本特征和各自的病毒學(xué)特點(diǎn)也很重要。就以上兩個(gè)問(wèn)題我們進(jìn)行了以下兩項(xiàng)臨床研究一非活動(dòng)性HBSAG攜帶者與HBEAG陰性慢性乙型肝炎患者病毒學(xué)特征的比較11研究目的為了探索HBSAGIACS向HBEAG（）CHB進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，對(duì)自然轉(zhuǎn)歸的HBSAGIACS和HBEAG（）CHB兩組人群的HBV基因型、PC的G1896和BCP的A1762G1764變異等病毒學(xué)特征分別進(jìn)行比較。12研究方法按照2005年慢性乙型肝炎防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行HBSAGIACS和HBEAG（）CHB患者的血清收集。采用QIAGENBLOODDNA檢測(cè)試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）分別對(duì)187例HBSAGIACS血清、99例HBEAG（）CHB血清進(jìn)行HBVDNA提取，然后利用半巢式PCR進(jìn)行CX片段（NT1643NT1974）擴(kuò)增，半巢式PCR的第一輪引物分別為P9和P35，第二輪引物為P9和CSP，用CSP引物作測(cè)序引物，使用ABI3730測(cè)序儀（APPLIEDBIOSYSTEMS，美國(guó)）直接測(cè)序。HBV基因組第1762A1764T以及第1896G核苷酸變異的判斷采用CLUSTERⅩ進(jìn)行序列排列和人工確認(rèn)?；蛐团袛嗖捎肞CR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRRFLP）方法，用PCRRFLP方法判定不出基因型的標(biāo)本采用直接測(cè)序方法判斷（同研究二中基因型確定的方法）。13研究結(jié)果187例HBSAGIACS組中113例HBSAGIACS血清HBVDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，其中103份完成CX片段（NT1643NT1974）測(cè)序，HBEAG（）CHB組中99份血清全部HBVDNAPC擴(kuò)增陽(yáng)性，全部完成CX片段（NT1643NT1974）測(cè)序。HBSAGIACS組中HBV基因B型比例高于HBEAG（）CHB組（84113VS4699，743VS465，P0000）；HBSAGIACS組的G1896A變異比例高于HBEAG（）CHB組（69103VS3999，670VS394，P0000），但A1762TG1764A變異株比例低于后者（38103VS6399，369VS636P0000）。經(jīng)二分類(lèi)LOGISTIC回歸分析得出男性（7519，95CI269320995，P0000）、年齡超過(guò)40歲（25369，95CI5323120913，P0000）以及基因C型感染（2309，95CI10285186，P0043）是與HBEAG（）CHB相關(guān)的危險(xiǎn)因素的結(jié)論，并未發(fā)現(xiàn)A1762TG1764A變異（2017，95CI09584247，P0065）與G1896A變異（0565，95CI02651205，P0140）有明顯的獨(dú)立預(yù)測(cè)HBEAG（）CHB的作用。14研究結(jié)論HBSAGIAC在病毒學(xué)特征上與HBEAG（）CHB明顯不同；HBV基因C型（HBVC）感染、年齡大的男性HBSAGIACS相對(duì)容易向HBEAG（）CHB發(fā)展。二NA治療HBEAG（）CHB完全應(yīng)答患者的病毒學(xué)特點(diǎn)21研究目的為了認(rèn)識(shí)NCRECHB和HBSAGIAC兩組人群HBSAGIAC狀態(tài)的穩(wěn)定性的差異、影響NA療效的因素，對(duì)NCRECHB和HBSAGIAC兩組人群的宿主基本特征及HBV的基因型、PC的G1896A和BCP的A1762TG1764A變異等病毒學(xué)特征方面進(jìn)行比較。22研究方法首先按照2005年慢性乙型肝炎防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集NCRECHB（治療組）和HBSAGIACS（對(duì)照組）的血清收集。采用QIAGENBLOODDNA檢測(cè)試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）分別對(duì)117例NCRECHB和58例HBSAGIACS進(jìn)行HBVDNA提取，然后以BS1和POL2為外引物、YS1和YS2為內(nèi)引物行巢式PCR對(duì)S區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)HBVDNAS區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本的PCR產(chǎn)物利用RFLP法進(jìn)行內(nèi)切酶酶切、電泳、觀察條帶基因分型，基因分型不明確的再進(jìn)行測(cè)序鑒定基因型。再利用巢式PCR對(duì)117例NCRECHB和58例HBSAGIACS進(jìn)行PC和BCP區(qū)兩個(gè)片段的擴(kuò)增以P9、CSP為第一輪引物，再分別以P9、P11和CE、CSP為第二輪引物，共用第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行BCP和PC區(qū)兩個(gè)片段的PCR擴(kuò)增，再利用錯(cuò)配PCRRFLP方法對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本的第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切確定變異情況，不能酶切的標(biāo)本再行研究一所述的半巢式PCR對(duì)CX片段（NT1643NT1974）進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)CX片段（NT1643NT1974）陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用CLUSTERX進(jìn)行序列排列和人工確認(rèn)以對(duì)G1896A和A1762TG1764A進(jìn)行檢測(cè)。23研究結(jié)果NCRECHB組男性比例高于HBSAGIAC組（778VS586，P0008），NCRECHB組的平均年齡大于HBSAGIAC組（T2267，P0025），NCRECHB組中血清HBVDNAS區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性率低于HBSAGIAC組中血清HBVDNAS區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性率（521VS793，P0001），經(jīng)PCRRFLP和測(cè)序的方法分析得出NCRECHB組中1例A型、44例B型、16例C型，HBSAGIAC組中33例B型、10例C型、2例D型、1例基因型不明，兩組的主要基因型構(gòu)成比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（X20154，P0694）；使用酶切和部分PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法總計(jì)得出NCRECHB組BCP區(qū)A1762TG1764A檢出率顯著低于HBSAGIAC組（98VS414，P0002），PC區(qū)G1896A檢出率亦明顯低于HBSAGIAC組（140VS724，P0000）。24研究結(jié)論NCRECHB人群的潛在病毒水平較HBSAGIAC的低。兩組人群中感染的主要HBV基因型構(gòu)成比沒(méi)有明顯差異，都是以B基因型為主。NCRECHB患者G1896A和A1762TG1764A變異檢出率分別低于HBSAGIAC的以上兩區(qū)域的變異檢出率。

簡(jiǎn)介：為了探索HBV新的基因治療手段我們選擇了X基因作為治療的靶開(kāi)展了以基因工程DN突變體為手段針對(duì)HBV的基因治療以期通過(guò)相關(guān)的研究獲得一至數(shù)個(gè)以X基因?yàn)榘心苡行б种艸BV復(fù)制的X基因DN突變體并證實(shí)X基因作為一個(gè)HBV治療的靶的可能性結(jié)論X基因DN突變體XGFP和XGFP具有顯著抑制病毒復(fù)制和基因表達(dá)作用但其作用不能完全清除病毒復(fù)制只能相當(dāng)程度的抑制病毒復(fù)制和基因表達(dá)提示以X基因作為靶針對(duì)X基因的治療可以顯著抑制HBV的復(fù)制X基因是一個(gè)新的抗HBV治療的靶X基因DN突變體對(duì)病毒復(fù)制影響是一個(gè)多環(huán)節(jié)多步驟過(guò)程能抑制病毒復(fù)制中間體RCDNASSDNADSDNA及PGRNA形成X基因DN突變體抗HBV復(fù)制作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性并與DN突變體在細(xì)胞漿中表達(dá)及反式激活功能有關(guān)

簡(jiǎn)介：人腸道病毒71型HUMANENTEROVIRUS71，EV71是1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出來(lái)的。不同亞型感染后臨床癥狀不完全相同，通常導(dǎo)致手足口病HFOOTMOUTHDISEASE，HFMD。重癥手足口病可導(dǎo)致無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，致殘及病死率較高。自1974年首次報(bào)道以來(lái)，EV71已在世界范圍內(nèi)引起十多次爆發(fā)與流行。在我國(guó)，手足口病曾經(jīng)在南方許多省市發(fā)生過(guò)數(shù)次大規(guī)模流行，成為嚴(yán)重威脅人民健康的重大傳染病之一，目前尚無(wú)有效的藥物和疫苗。我國(guó)研究人員病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室金奇教授等在1998年率先測(cè)定了EV71的基因全序列。EV71是小RNA病毒科，腸道病毒屬成員。病毒基因組為約7500個(gè)核苷酸的單股正鏈RNA，基因組中儀有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼約2200個(gè)氨基酸的無(wú)生物活性的EV71多聚蛋白前體POLYPROTEIN。該多聚蛋白需進(jìn)一步被剪切，產(chǎn)生成熟的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。這些過(guò)程主要依賴(lài)于EV713C蛋白酶。EV713C蛋白酶不但可以對(duì)病毒前體蛋白進(jìn)行剪切，還可以降解宿主蛋白，如多聚腺嘌呤核苷酸修飾調(diào)控蛋白（CLEAVAGESTIMULATIONFACT64，CSTF64），從而干擾宿主MRNA合成。最近的研究表明EV713C能夠通過(guò)結(jié)合視黃酸誘導(dǎo)基因1RETINOIDACIDINDUCIBLEGENEⅠ，RIGⅠ受體從而干擾RIGⅠ類(lèi)解旋酶引發(fā)的天然免疫應(yīng)答。除了蛋白酶功能以外，EV713C還具有識(shí)別病毒基因組RNA5非翻譯區(qū)UNTRANSLATEDREGIONS，UTR的活性，暗示了EV713C可能參與病毒RNA基因組復(fù)制的過(guò)程?；贓V713C在病毒生命周期和病毒宿主相互作用過(guò)程中的重要功能，該蛋白被認(rèn)為是抗病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)之一。由于EV713C蛋白酶尚無(wú)結(jié)構(gòu)信息，極大地限制了結(jié)構(gòu)導(dǎo)向性EV713C蛋白酶抑制劑的研究。本研究首次解析了高分辨率10A的EV713C蛋白及其與RUPINTRIVIRAG7088，蘆平曲韋形成復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，EV713C的基本結(jié)構(gòu)與其它小RNA病毒3C蛋白酶相似，具有絲氨酸蛋白酶家族的典型折疊。我們發(fā)現(xiàn)EV713C蛋白酶的Β折疊環(huán)維持了罕見(jiàn)的開(kāi)放構(gòu)象，而這一重要的結(jié)構(gòu)元件在其他結(jié)構(gòu)已知的3C蛋白酶中維持閉合構(gòu)象。通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)位于Β折疊環(huán)底部的保守氨基酸GLY123和HIS133，可起到鉸鏈作用，從而控制Β折疊環(huán)的構(gòu)象變化。通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)我們證明了兩個(gè)鉸鏈氨基酸肽鍵的靈活性在EV713C蛋白酶底物識(shí)別和底物水解中起到重要作用。RUPINTRIVIR是通過(guò)模擬肽底物設(shè)計(jì)的一種抗人鼻病毒HUMANRHINOVIRUS，HRV3C蛋白酶的抑制劑，最近研究證明它也能有效抑制一些腸道病毒。我們發(fā)現(xiàn)RUPINTRIVIR可以有效抑制EV71病毒BJCHN2008復(fù)制，并在體外抑制EV713C的蛋白酶活性。為了闡明RUPINTRIVIR抗EV71的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了EV713C蛋白酶RUPINTRIVIR共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)獲得了高分辨率的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，RUPINTRIVIR不可逆的結(jié)合在EV713C蛋白酶底物識(shí)別口袋中，其結(jié)合模式大體類(lèi)似于RUPINTRIVIR與HRV3C的相互作用。RUPINTRIVIR的C端部分不能穩(wěn)定的結(jié)合在EV713C蛋白酶的離去集團(tuán)口袋中。通過(guò)EV713CRUPINTRIVIR復(fù)合物分子表面繪圖發(fā)現(xiàn)EV713C蛋白酶底物識(shí)別區(qū)中存在一個(gè)凹陷的S2口袋。類(lèi)似的結(jié)構(gòu)特征不存在于HRV3C蛋白酶結(jié)構(gòu)中，但是存在于柯薩奇病毒COXSACKIEVIRUSB，CVB3C蛋白酶和脊髓灰質(zhì)炎病毒POLIOVIRUS，PV3C蛋白酶結(jié)構(gòu)中。結(jié)合點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)我們證明了GLU71對(duì)于保持具有催化活性的HIS40的有效性構(gòu)象具有不可替代的作用，從而進(jìn)一步支持這類(lèi)蛋白酶具有催化三聯(lián)體的蛋白酶水解機(jī)制的假說(shuō)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還揭示了一個(gè)以往沒(méi)有描述過(guò)的保守氨基酸ARG39在EV713C蛋白酶催化過(guò)程中可起“中和凈帶電性”的作用，它通過(guò)減弱GLU71的靜負(fù)電性協(xié)助HIS40的去質(zhì)子化過(guò)程。

簡(jiǎn)介：輪狀病毒ROTAVIRUSRV是嬰幼兒胃腸炎的主要病原世界范圍內(nèi)的兒童幾乎全都感染過(guò)RV對(duì)、RV的感染除了對(duì)癥處理外并無(wú)特效藥物因此研究和開(kāi)發(fā)安全有效的輪狀病毒疫苗具有很需要意義輪狀病毒疫苗的研究工作雖然取得了一些成績(jī)但總體而言以往開(kāi)發(fā)的預(yù)防疫苗因各種原因均達(dá)不到應(yīng)有的效果RV疫苗必須進(jìn)一步深入研究研究結(jié)果表明用FHVRNA為載體可在PETPETRNAREABC系統(tǒng)BL21DE3中穩(wěn)定、高效地表達(dá)重組RV抗原表位RNAREABC可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗RV血清抗體用重組RV抗原表位RNAREABC免疫小鼠可保護(hù)小鼠免受參照RV株SA11和WA的攻擊減輕臨床癥狀減小病毒排出量減少病毒排出時(shí)間該研究結(jié)果提示用FHVRNA作載體表達(dá)的重組RV抗原表位RNAREABC能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用為進(jìn)一步發(fā)展重組RV抗原表位亞單位疫苗打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文人免疫缺陷病毒調(diào)升基因AEG1促腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用與分子機(jī)制研究姓名楊樂(lè)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)微生物學(xué)指導(dǎo)教師黎孟楓20090525中I山大學(xué)碩士論文人免疫缺陷病毒調(diào)升基因AEG1促腫瘤細(xì)胞增羅II的生物學(xué)作用與分子機(jī)制研究腺癌的關(guān)鍵。目前的研究表明乳腺癌的發(fā)生受基因與環(huán)境兩大因素的影響，但對(duì)其發(fā)病的具體的分子機(jī)制卻知之甚少，乳腺癌的預(yù)后的判斷仍然依賴(lài)于一些常規(guī)的臨床與影像學(xué)指標(biāo)，例如，腫瘤的大小，病理分級(jí)，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。至今為止，已有許多基因被認(rèn)為足與乳腺癌轉(zhuǎn)移和或預(yù)后有關(guān)的標(biāo)記物，但仍缺乏獨(dú)立、有效的乳腺癌診斷指標(biāo)和與預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物。因此，闡述乳腺癌發(fā)牛、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找特異性診斷和治療靶標(biāo)是目前乳腺癌基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。本文旨在研究AEGL基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖的影響，并探討其在入乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)理。首先，本文做免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織中AEG一1與KI67的臨床相關(guān)性。隨后建立了兩株穩(wěn)定外源性高表達(dá)AEGL和兩株下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性AEG一1表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系，用于檢測(cè)AEG1與乳腺癌細(xì)胞增殖的相關(guān)性。本文的數(shù)據(jù)顯示，上調(diào)AEG1的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和其非錨定依賴(lài)性牛長(zhǎng)的能力，反之下調(diào)內(nèi)源性AEG1的表達(dá)則可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，AEG1可能足促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞異常增生的重要分子。通過(guò)對(duì)AEG1促增殖機(jī)制的研究，本文發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞增殖加快與細(xì)胞周期抑制物P27KIPL5陽(yáng)P21CI01P有關(guān)，進(jìn)而證明了AEG1是通過(guò)P13K／AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)FOXOL的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的。本文的發(fā)現(xiàn)首次闡述了AEGL促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，提示AEGL基因在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)腱過(guò)程中起重要作用，可能成為有價(jià)值的腫瘤分子治療的潛在靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞AEG1乳腺癌增殖

簡(jiǎn)介：目的該次研究目的是了解武漢地區(qū)輪狀病毒性腹瀉的主要流行毒株以及A組輪狀病毒的基因型和亞組的流行特征并對(duì)B組輪狀病毒進(jìn)行基因序列分析為確立我國(guó)輪狀病毒的主要流行株以及構(gòu)建有效的輪狀病毒疫苗奠定分子流行病學(xué)基礎(chǔ)方法利用共用的下游引物RVG9和6個(gè)A組輪狀病毒G基因型G14、G8和G9的特異性上游引物建立一步多重RTPCR方法檢測(cè)G基因型利用引物CON2、CON3進(jìn)行第一輪RTPCR以5個(gè)P基因型P6、P8、P9、P4和P10的特異性引物進(jìn)行第二輪PCR建立多重巢式RTPCR方法檢測(cè)P基因型2002年11月2003年10在武漢市兒童醫(yī)院腹瀉門(mén)診按系統(tǒng)抽樣方法收集5歲以下兒童腹瀉樣本利用聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE檢出輪狀病毒陽(yáng)性樣本進(jìn)行G、P基因分型和VP6亞組分析不能分型樣本利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并對(duì)其基因序列進(jìn)行分析另外對(duì)2000年12月2002年12月在武漢地區(qū)發(fā)現(xiàn)的兩例B組輪狀病毒利用PCR擴(kuò)增其VP7、NSP2和NSP5基因并連接到克隆載體PUCMT上轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞ONESHOTTOP10F提取轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶PSTⅠ酶切分析篩選出陽(yáng)性菌提取質(zhì)粒對(duì)插入片段進(jìn)行了測(cè)序和核苷酸序列分析結(jié)論該研究是首次對(duì)武漢地區(qū)輪狀病毒進(jìn)行了系統(tǒng)的分子流行病學(xué)分析武漢地區(qū)存在A組和B組輪狀病毒其中A組輪狀病毒以G3P8型為優(yōu)勢(shì)流行株亞組以基因亞組3為主B組輪狀病毒與ADRV起源相同且在20年里變異很小基因序列比較保守此結(jié)果將為我國(guó)病毒性腹瀉的分子流行病學(xué)研究提供參考并為輪狀病毒疫苗的研制及評(píng)估提供了一定的分子流行病學(xué)基礎(chǔ)

簡(jiǎn)介：1HBEAG陰性慢性乙型肝炎的流行率為359﹪與HBEAG陽(yáng)性組比較HBEAG陰性組CHB的HBVDNA水平顯著降低而肝組織病理的炎癥分級(jí)、纖維化分期偏重的比例均顯著增高HBEAG陰性組CHB隨HBVDNA水平升高ALT水平、肝組織炎癥分級(jí)和纖維分期均相應(yīng)增高而HBEAG陽(yáng)性組CHB隨HBVDNA水平升高ALT水平、肝組織炎癥分級(jí)與纖維化分期均相應(yīng)較低2HBEAG陰性的HBV感染者中X基因因插入、缺失、點(diǎn)突變等變異所致的X蛋白的截短與HBV低水平復(fù)制及肝炎靜息的無(wú)癥狀攜帶臨床現(xiàn)象密切相關(guān)3采用分子克隆、人工定點(diǎn)突變等技術(shù)成功地構(gòu)建了20DP38Ⅰ、21DP38Ⅰ、20DA1896P38Ⅰ、21DA1896P38Ⅰ四株含12拷貝HBV全基因的突變載體4HBVCP2021BPNT174717481767缺失株及同時(shí)存在的A點(diǎn)變異株的病毒抗原表達(dá)、病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄水平均較野毒株顯著下降可解釋HBEAG陰性的HBV低水平復(fù)制的臨床現(xiàn)象520BP與21BP缺失的CP其啟動(dòng)子活性順式調(diào)節(jié)作用均較野毒株型顯著下降20BP與21BP缺失株X蛋白分別表現(xiàn)為無(wú)和微弱的轉(zhuǎn)式激活作用因而可從理論上闡明CP2O21BP缺失變異株生物學(xué)活性低下的特點(diǎn)

簡(jiǎn)介：南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文EB病毒潛伏膜蛋白2A多表位重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化、單克隆抗體的制備及其在血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用姓名許文嶸申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)微生物指導(dǎo)教師姚堃20070420南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文英文縮寫(xiě)MABNⅡC姍NPCODPBSPCRPEGPRISTANEPVDFRNARPMSAS田ⅥBTNF英文全稱(chēng)MONOCLONALANTIBODYMAJORHISTOCOMPATIBILITYCOMPLEXMAGNETICRESONANCEIMAGINGNASOPHARYNGEALCARCINOMAOPTICALDENSITYPHOSPHATEBUFFEREDSALINEPOLYMERASECHAINREACTIONPOLYETHYLENEGLYCEROLPRISTANEPOLYVINYLIDENEDIFLUORIDERIBONUCLEICACIDROLLSPERMINUTESATURATEDARNMONIUMSULFATETETRAMETHYLBENZIDINETUMORNECROSISFACTOR3中文全稱(chēng)單克隆抗體主要組織相容性復(fù)合體磁共振成像鼻咽癌光密度磷酸緩沖液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚乙二醇降植烷聚偏氟乙烯核糖核酸每分鐘轉(zhuǎn)速飽和硫酸銨四甲基聯(lián)苯胺腫瘤壞死因子

簡(jiǎn)介：肝細(xì)胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居我國(guó)癌癥死亡的第三位。大約有80％的HCC與乙肝病毒HEPTITISBVIRUS，HBV感染有關(guān)，其致病機(jī)理比較復(fù)雜，危害嚴(yán)重。HBV基因組包含4個(gè)開(kāi)放閱讀框，包括S、C、P和X區(qū)，分別編碼相應(yīng)的抗原蛋白。HBX是HBV基因組所編碼蛋白質(zhì)中唯一具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)，可反式激活一些細(xì)胞的原癌基因及病毒的基因，HBX通過(guò)多種方式直接或間接地對(duì)病毒自身的復(fù)制與增殖以及宿主細(xì)胞中基因的表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞的凋亡與癌變等過(guò)程產(chǎn)生廣泛的影響。HBX的這種現(xiàn)象與機(jī)制在近些年成為研究的熱點(diǎn)，逐漸闡明HBX與宿主蛋白質(zhì)廣泛地相互作用，但HBX誘發(fā)肝細(xì)胞癌的具體機(jī)制仍不完全清楚。本研究利用二維差異凝膠電泳技術(shù)TWODIMENSIONALDIFFERENTIALINGELELECTROPHESIS，DIGE，以期通過(guò)比較相關(guān)肝細(xì)胞在轉(zhuǎn)染HBX前后細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，找到HBX與HCC密切相關(guān)的差異蛋白。為了進(jìn)行乙型肝炎病毒HBVX基因相關(guān)肝細(xì)胞癌變的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，我們構(gòu)建了HBX相關(guān)的肝細(xì)胞模型。首先參考GENBANK核苷酸序列庫(kù)中的HBV核苷酸序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)用于HBX基因擴(kuò)增的引物，以質(zhì)粒V5為模板，擴(kuò)增兩端分別包含ECⅠ和HINDⅢ酶切位點(diǎn)的X基因序列。然后將EGFP載體及X基因的PCR產(chǎn)物雙酶切后用T4連接酶將兩者連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JML09，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為EGFPHBX。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞CHANGLIVER及HEPG2，激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，并挑選已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，在G418的作用下篩選穩(wěn)定株細(xì)胞，使用RTPCR和WESTERNBLOTTING檢測(cè)HBX的表達(dá)情況，進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析HBX轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞CHANGLIVER后細(xì)胞周期發(fā)生的變化。雙酶切結(jié)果和序列分析表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。激光共聚焦顯微鏡下觀察到HBX轉(zhuǎn)染到HEPG2的效率要比CHANGLIVER高，RTPCR和WESTERNBLOTTING結(jié)果都能證實(shí)HBX在細(xì)胞CHANGLIVER及HEPG2已表達(dá)，而且流式細(xì)胞術(shù)分析表明HBX蛋白加快了細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)一步證實(shí)HBX能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。利用二維差異凝膠電泳技術(shù)DIGE技術(shù)研究肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異時(shí)應(yīng)先對(duì)其蛋白樣品進(jìn)行標(biāo)記系統(tǒng)評(píng)估，以確保正式實(shí)驗(yàn)的成功。我們對(duì)提取樣品進(jìn)行了2DE的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其重復(fù)性都能達(dá)到90％以上。然后將提取的細(xì)胞蛋白經(jīng)DIGETM試劑盒的3重?zé)晒釩Y2、CY3、CY5標(biāo)記后再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳SDSPAGE和雙向電泳2DE，TWODIMENSIONALELECTROPHESIS。SDSPAGE掃描后的圖像使用IMAGEQUANT軟件進(jìn)行分析，結(jié)果說(shuō)明肝癌細(xì)胞蛋白提取液與該染料能相互兼容，樣品得到了有效的標(biāo)記，且蛋白量與熒光強(qiáng)度之間有較好的線性關(guān)系。2DE的掃描圖像使用DECYDER50軟件的DIADIFFERENTIALINGELANALYSIS和BVABIOLOGICALVARIATIONANALYSIS模式分析，結(jié)果說(shuō)明CY3和CY5標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量結(jié)果基本一致，但該染料標(biāo)記肝癌細(xì)胞蛋白后會(huì)造成極少量蛋白如低分子量蛋白和極酸性極堿性蛋白出現(xiàn)位置偏差，給蛋白定量帶來(lái)一定的誤差，而B(niǎo)VA中的反標(biāo)策略能夠有效糾正這種由于不同熒光標(biāo)記帶來(lái)的定量誤差?？傊?，我們對(duì)整個(gè)DIGE實(shí)驗(yàn)流程都進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和標(biāo)記評(píng)價(jià)都獲得了較好的結(jié)果，達(dá)到了滿(mǎn)意的定量效果，提示該蛋白完全可以進(jìn)行正式2DDIGE實(shí)驗(yàn)。我們首次報(bào)道了用同一肝癌樣品進(jìn)行不同熒光標(biāo)記后進(jìn)行2DE的評(píng)估方法，該方法支持了DIGE體系定量的可靠性，而且能給出定量的誤差范圍，更進(jìn)一步地完善了DIGE技術(shù)的評(píng)估體系，為DIGE技術(shù)平臺(tái)的質(zhì)量控制提供了很好的參考。在肝癌細(xì)胞蛋白樣品的2DDIGE技術(shù)體系成熟之后，我們利用該技術(shù)結(jié)合生物質(zhì)譜MALDITOFTOFMSMS比較了HBX基因在轉(zhuǎn)染相應(yīng)肝細(xì)胞系CHANGLIVER和HEPG2細(xì)胞前后的差異，及HBV整合進(jìn)細(xì)胞HEPG2后的變化，并對(duì)部份蛋白進(jìn)行了鑒定，以期探索HBX造成細(xì)胞癌變的機(jī)理。在P＜005、|RATION|＞2時(shí)我們?cè)谝陨先齻€(gè)比較組里分別找到了25、30、159個(gè)差異蛋白。統(tǒng)計(jì)分析后可以提出具體差異蛋白的蛋白點(diǎn)號(hào)，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)在CHANGLIVER_HBX的差異點(diǎn)有8個(gè)可以在HBV組中找到，而HEPG2_HBX組的差異點(diǎn)只有2個(gè)能在HBV組找到，這兩個(gè)細(xì)胞系組別里只有1個(gè)共同的差異點(diǎn)，說(shuō)明這兩個(gè)細(xì)胞系本身的區(qū)別較之于HBX的轉(zhuǎn)染后造成的區(qū)別更大。目前我們分別已鑒定了8、11、51個(gè)差異蛋白，分別涉及病毒細(xì)胞周期、糖代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等等。

簡(jiǎn)介：西尼羅病毒W(wǎng)NV感染是一種經(jīng)蚊蟲(chóng)傳播、以鳥(niǎo)類(lèi)為主要?jiǎng)游锼拗鞯淖匀灰咴葱约膊。谂R床上可表現(xiàn)為西尼羅熱或西尼羅腦炎，病死率4～11％。我國(guó)尚無(wú)WNV感染的病例報(bào)道，但其潛在危害仍需足夠重視。本研究從媒介蚊、蜱、宿主鼠、蝙蝠及人群對(duì)我國(guó)9個(gè)省市18個(gè)地區(qū)進(jìn)行了WNV和與其同屬一個(gè)血清組的流行性乙型腦炎病毒JEV感染的流行病學(xué)調(diào)查，未能在蚊蟲(chóng)、鼠、蝙蝠、人血清標(biāo)本中檢測(cè)到病原體核酸；云南、福建、浙江、內(nèi)蒙存在WNV、JEV等黃病毒抗體，總陽(yáng)性率274％；WNV與JEV間存在免疫交叉反應(yīng)。進(jìn)一步采用在我國(guó)廣泛使用的JEVSAL4142減毒疫苗免疫小鼠，進(jìn)行體外中和試驗(yàn)對(duì)WNV和JEV的免疫交叉保護(hù)作用進(jìn)行研究，表明WNV與JEV存在較強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng)，JEV減毒活疫苗免疫小鼠血清對(duì)WNV具有中和作用。為有效鑒別WNV與JEV感染，進(jìn)一步建立了ELISA檢測(cè)方法，該方法有較好的特異性。對(duì)IFA、MCPENT、ELISA關(guān)系進(jìn)行了初步研究，顯示MCPENT與ELISA存在相關(guān)關(guān)系。上述研究結(jié)果提示JEV減毒活疫苗能夠一定程度抵抗WNV攻擊，結(jié)合我國(guó)JEV免疫免疫水平，推測(cè)WNV在我國(guó)廣泛流行的可能性不大。

簡(jiǎn)介：目的本研究通過(guò)山東省自2000年實(shí)現(xiàn)無(wú)脊灰目標(biāo)后開(kāi)展脊灰病毒學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)山東省AFP及其病毒學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的敏感性、及時(shí)性、準(zhǔn)確性和完整性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，監(jiān)測(cè)AFP病例脊灰病毒PV及其人類(lèi)腸道病毒HEV的攜帶狀態(tài)，分析PV株的變異情況，并對(duì)疫苗變異株P(guān)V進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，探索其規(guī)律和特點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)山東省維持無(wú)脊灰狀態(tài)的成果。通過(guò)2007年山東省首次發(fā)現(xiàn)的疑似VDPV病例開(kāi)展深入的調(diào)查和處理，對(duì)所采取的應(yīng)急處置措施及其效果進(jìn)行全面分析、評(píng)價(jià)和總結(jié)，為國(guó)家制訂和完善針對(duì)VDPV事件的應(yīng)急處置技術(shù)方案提供科學(xué)的依據(jù)。第一部分山東省實(shí)現(xiàn)無(wú)脊髓灰質(zhì)炎目標(biāo)后病毒學(xué)監(jiān)測(cè)分析方法通過(guò)全省AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，對(duì)2000～2007年報(bào)告的AFP病例采集糞便標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。病毒分離、型別鑒定以及血清中和抗體試驗(yàn)，采用WHO脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)規(guī)定的方法。對(duì)分離到的PV陽(yáng)性株，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析PCRRFLP方法進(jìn)行型內(nèi)鑒定，型內(nèi)鑒定陽(yáng)性的病毒株測(cè)定其VP1基因全長(zhǎng)，采用SEQUENCHER、DNASTAR等軟件進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)論山東省AFP及其病毒學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)具有較高的敏感性、及時(shí)性、完整性和準(zhǔn)確性，未再發(fā)現(xiàn)脊灰野病毒株，掌握了山東省疫苗株脊灰病毒的分布特征和疫苗變異株脊灰病毒的分子生物學(xué)特征。建議在提高疫苗接種率的同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)AFP病例的病毒學(xué)監(jiān)測(cè)工作，密切關(guān)注疫苗株脊灰病毒的變異情況，及早發(fā)現(xiàn)輸入性野毒株脊灰病毒和疫苗衍生株脊灰病毒，迅速采取應(yīng)急措施阻斷病毒的傳播，繼續(xù)維持無(wú)脊灰狀態(tài)直至全球?qū)崿F(xiàn)消滅脊灰的目標(biāo)。第二部分山東省首次發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎疫苗衍生病毒事件的應(yīng)急處置及其評(píng)價(jià)方法對(duì)2007年4月山東省首次發(fā)現(xiàn)的VDPV事件，運(yùn)用現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)爆發(fā)調(diào)查、快速評(píng)價(jià)與主動(dòng)監(jiān)測(cè)、病例管理、病毒學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測(cè)、應(yīng)急免疫干預(yù)等方法進(jìn)行綜合處置，并對(duì)調(diào)查結(jié)果和應(yīng)急處置效果進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià)。結(jié)論山東省兩例VDPV病例是相互獨(dú)立的，沒(méi)有形成CVDPVS；針對(duì)本次VDPV事件采取的一系列應(yīng)急處置措施，明確了病例診斷，確定VDPV的屬性，阻斷了VDPV傳播擴(kuò)散，取得了良好的效果，為今后我國(guó)規(guī)范處置此類(lèi)應(yīng)急事件積累了經(jīng)驗(yàn)，為免疫策略調(diào)整提供了科學(xué)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建漢坦病毒HANTAVIRUS，HVGM0438株包膜糖蛋基因G1、G2的真核表達(dá)載體，并將其在VEROE6細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，研究其表達(dá)特點(diǎn)，并且觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)生，為研究漢坦病毒基因結(jié)構(gòu)與功能、病毒糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、研制有效的漢坦病毒基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建漢坦病毒糖基化位點(diǎn)的突變體，對(duì)以后研究糖基化位點(diǎn)改變對(duì)細(xì)胞融合的影響具有重要意義。方法根據(jù)GENBANKSEO型HVM、S片段CDNA基因保守序列及相關(guān)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒PUCMM1和PMD18M2為模板，應(yīng)用PCR方法分別擴(kuò)增HV糖蛋白G1、G2的全長(zhǎng)基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體PCAGGSMCS分別雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Α，經(jīng)氨芐篩選，酶切和測(cè)序鑒定正確后，兩種載體分別命名為PCAGGSG1、PCAGGSG2，然后將兩種糖蛋白載體共轉(zhuǎn)染VEROE6細(xì)胞，酸性MEM處理、GIEMSA染色后觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象的產(chǎn)生。同時(shí)用PCAGGSNP與兩種糖蛋白載體共表達(dá)，看核蛋白是否對(duì)糖蛋白的融合有增強(qiáng)作用，并以間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)INDIRECTIMMUNOFLUESCENCEASSAY，IIFA來(lái)觀察糖蛋白和核蛋白的表達(dá)情況。利用基因定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了五個(gè)糖蛋白突變體，即將G1、G2上的的天冬酰胺置換為丙氨酸，根據(jù)被替換的位置，突變體分別命名為N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。結(jié)果1構(gòu)建了含有包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表達(dá)載體PCAGGSG1和PCAGGSG2，雙酶切鑒定目的片段分別為20KB和15KB，載體片段為47KB并測(cè)序證實(shí)。2間接免疫熒光試驗(yàn)顯示糖蛋白組、核蛋白組及兩者的共表達(dá)組皆有亮綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生，呈胞漿分布。3糖蛋白G1、G2共轉(zhuǎn)染后在偏酸性條件下可引起VEROE6細(xì)胞發(fā)生融合，而轉(zhuǎn)染PCAGGSNP的細(xì)胞則沒(méi)有融合現(xiàn)象發(fā)生將核蛋白與糖蛋白共表達(dá)后也未出現(xiàn)明顯的促進(jìn)效應(yīng)。4構(gòu)建了五個(gè)N連糖基化位點(diǎn)的突變體，測(cè)序圖譜顯示原序列中的天冬酰胺N均被置換為丙氨酸A。結(jié)論成功構(gòu)建了漢坦病毒包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表達(dá)載體并在VEROE6細(xì)胞中有效表達(dá)，二者的共表達(dá)可以產(chǎn)生良好的生物學(xué)活性，在酸性條件下引起VEROE6細(xì)胞發(fā)生融合。為進(jìn)一步研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，制備有效的亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。成功構(gòu)建了各糖基化位點(diǎn)的突變體，為進(jìn)一步研究N連糖基化的缺失對(duì)細(xì)胞融合的影響提供了必要條件。