EV71 3C蛋白酶及其與抗病毒藥物相互作用的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、人腸道病毒71型(human enterovirus 71，EV71)是1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出來(lái)的。不同亞型感染后臨床癥狀不完全相同，通常導(dǎo)致手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)。重癥手足口病可導(dǎo)致無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，致殘及病死率較高。自1974年首次報(bào)道以來(lái)，EV71已在世界范圍內(nèi)引起十多次爆發(fā)與流行。

2、在我國(guó)，手足口病曾經(jīng)在南方許多省市發(fā)生過(guò)數(shù)次大規(guī)模流行，成為嚴(yán)重威脅人民健康的重大傳染病之一，目前尚無(wú)有效的藥物和疫苗。
　　我國(guó)研究人員病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室金奇教授等在1998年率先測(cè)定了EV71的基因全序列。EV71是小RNA病毒科，腸道病毒屬成員。病毒基因組為約7500個(gè)核苷酸的單股正鏈RNA，基因組中儀有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼約2200個(gè)氨基酸的無(wú)生物活性的EV71多聚蛋白前體(polyprotein)。該多聚蛋白需進(jìn)

3、一步被剪切，產(chǎn)生成熟的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。這些過(guò)程主要依賴(lài)于EV713C蛋白酶。EV713C蛋白酶不但可以對(duì)病毒前體蛋白進(jìn)行剪切，還可以降解宿主蛋白，如多聚腺嘌呤核苷酸修飾調(diào)控蛋白（cleavage stimulation factor-64，CstF-64），從而干擾宿主mRNA合成。最近的研究表明EV713C能夠通過(guò)結(jié)合視黃酸誘導(dǎo)基因-1(retinoid acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)受體從而干擾RI

4、G-Ⅰ類(lèi)解旋酶引發(fā)的天然免疫應(yīng)答。除了蛋白酶功能以外，EV713C還具有識(shí)別病毒基因組RNA5'-非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)的活性，暗示了EV713C可能參與病毒RNA基因組復(fù)制的過(guò)程。基于EV713C在病毒生命周期和病毒宿主相互作用過(guò)程中的重要功能，該蛋白被認(rèn)為是抗病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)之一。
　　由于EV713C蛋白酶尚無(wú)結(jié)構(gòu)信息，極大地限制了結(jié)構(gòu)導(dǎo)向性EV713C蛋白酶抑制劑的研究。本研究首

5、次解析了高分辨率(1.0(A))的EV713C蛋白及其與rupintrivir(AG7088，蘆平曲韋)形成復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，EV713C的基本結(jié)構(gòu)與其它小RNA病毒3C蛋白酶相似，具有絲氨酸蛋白酶家族的典型折疊。我們發(fā)現(xiàn):EV713C蛋白酶的β折疊環(huán)維持了罕見(jiàn)的開(kāi)放構(gòu)象，而這一重要的結(jié)構(gòu)元件在其他結(jié)構(gòu)已知的3C蛋白酶中維持閉合構(gòu)象。通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)位于β折疊環(huán)底部的保守氨基酸Gly123和His133，可

6、起到鉸鏈作用，從而控制β折疊環(huán)的構(gòu)象變化。通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)我們證明了兩個(gè)鉸鏈氨基酸肽鍵的靈活性在EV713C蛋白酶底物識(shí)別和底物水解中起到重要作用。Rupintrivir是通過(guò)模擬肽底物設(shè)計(jì)的一種抗人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)3C蛋白酶的抑制劑，最近研究證明它也能有效抑制一些腸道病毒。我們發(fā)現(xiàn)rupintrivir可以有效抑制EV71病毒(BJ/CHN/2008)復(fù)制，并在體外抑制EV713C的蛋白酶活性。為了闡明

7、rupintrivir抗EV71的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了EV713C蛋白酶/rupintrivir共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)獲得了高分辨率的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，rupintrivir不可逆的結(jié)合在EV713C蛋白酶底物識(shí)別口袋中，其結(jié)合模式大體類(lèi)似于rupintrivir與HRV3C的相互作用。Rupintrivir的C端部分不能穩(wěn)定的結(jié)合在EV713C蛋白酶的離去集團(tuán)口袋中。通過(guò)EV713C/rupintrivir復(fù)合物分子表面繪圖發(fā)現(xiàn)EV7

8、13C蛋白酶底物識(shí)別區(qū)中存在一個(gè)凹陷的S2'口袋。類(lèi)似的結(jié)構(gòu)特征不存在于HRV3C蛋白酶結(jié)構(gòu)中，但是存在于柯薩奇病毒(coxsackievirus B，CVB)3C蛋白酶和脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，PV)3C蛋白酶結(jié)構(gòu)中。結(jié)合點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)我們證明了Glu71對(duì)于保持具有催化活性的His40的有效性構(gòu)象具有不可替代的作用，從而進(jìn)一步支持這類(lèi)蛋白酶具有催化三聯(lián)體的蛋白酶水解機(jī)制的假說(shuō)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還揭示了一個(gè)以往沒(méi)有描述過(guò)的保守