EB病毒潛伏膜蛋白2A多表位重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化、單克隆抗體的制備及其在血清學(xué)檢測中的應(yīng)用.pdf

1、Epstein-Barr病毒(EBv)屬γ皰疹病毒亞科，在世界各地廣泛傳播，為95％成人所攜帶。鼻咽癌屬于EB病毒引起的一種最常見的非淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，全世界NPC病例80％發(fā)生于我國。鑒于鼻咽癌不能手術(shù)治療，而放療化療也不能有效清除腫瘤細(xì)胞，絕大多數(shù)病人易發(fā)生遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移，因此早期診斷和免疫治療顯得十分重要。EB病毒與NPC的發(fā)生密切相關(guān)。通過檢測EBV的抗體早期診斷NPC是提高NPC患者存活率的一個(gè)重要的手段。隨著對EBV的血清流行病

2、學(xué)的研究和分子生物學(xué)的發(fā)展，克隆、表達(dá)、純化EBV的蛋白或多肽，并以此為抗原建立簡便、快速、靈敏和特異的檢測EBV抗體的方法，是目前研究NPC診斷的主要發(fā)展方向。EB病毒潛伏膜蛋白2A(LMP2A)能穩(wěn)定表達(dá)于一些EBV相關(guān)腫瘤的細(xì)胞膜上，與病毒的潛伏感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，并參與調(diào)節(jié)跨膜信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其功能日益受到重視。 本研究用重疊PCR方法得到包含LMP2A四個(gè)主要抗原表位的基因序列，該重組基因命名為EC2A，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)

3、粒：pET32a-EC2A，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)并純化；以純化的融合蛋白為抗原免疫小鼠制備單克隆抗體并鑒定；初步應(yīng)用純化的蛋白來進(jìn)行EB病毒相關(guān)鼻咽癌病人的血清學(xué)檢測。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.EB病毒LMP2A多表位重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)及純化 運(yùn)用軟件對LMP2A編碼基因序列進(jìn)行分析，并預(yù)測其可能的抗原表位。經(jīng)重疊PCR得到包含LMP2A四個(gè)主要抗原表位的基因序列，重組基因命名為EC2A。構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒

4、pET32a-EC2A。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定、核酸序列測定和分析后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白用鎳柱親和層析純化，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白分子量約為40 kD。 2.EB病毒LMP2A多表位融合蛋白單克隆抗體的制備與鑒定 以純化的融合蛋白為抗原免疫小鼠，按常規(guī)方法融合，經(jīng)反復(fù)克隆及亞克隆后得到一株能穩(wěn)定分泌鼠抗人LMP2A單克隆抗體，命名為1F5。采

5、用腹水誘生的方法進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)，抗體腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法初步純化后濃度為10mg/ml。經(jīng)快速定性試紙法鑒定1F5的重鏈為IgGl，輕鏈為K。ELISA法分析表明，純化后單抗的效價(jià)為1:10000以上。Westem blot分析結(jié)果顯示這株單抗具有良好的識別LMP2A分子的特異性。 3.EB病毒LMP2A多表位融合蛋白在鼻咽癌血清學(xué)檢測中的應(yīng)用 以純化的蛋白作為抗原，用ELISA法檢測EB病毒相關(guān)鼻咽癌病人的血清