簡(jiǎn)介：南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)染人骨形成蛋白2基因共培養(yǎng)條件下NIH3T3細(xì)胞生物學(xué)性狀觀察姓名王娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師孫衛(wèi)斌20060418南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)染人骨形成蛋白2基因共培養(yǎng)條件下NLI13T3細(xì)胞生物學(xué)性狀觀察研究生王娟導(dǎo)師孫衛(wèi)斌教授中文摘要牙周治療的理想目標(biāo)就在于誘導(dǎo)牙周組織再生。新生牙槽骨是重建牙周新附著的基礎(chǔ)，沒(méi)有新生的牙槽骨，牙周纖維組織就沒(méi)有附著的錨地。骨形成蛋白BONEMORPHOGENETICPROTEIN，BMP屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B超家族成員，能在非骨組織如肌肉中誘導(dǎo)新骨形成，因而在骨生長(zhǎng)和骨缺損治療中極為重要。已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明局部運(yùn)用外源性重組BMP可以誘導(dǎo)牙周損傷區(qū)域牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周纖維組織的新生。但是，牙周組織的特點(diǎn)決定了局部應(yīng)用外源性BMP既很難達(dá)到所要求的濃度，又極易被體液稀釋流失，而且在一定程度上還有促進(jìn)細(xì)菌繁殖的可能。為了克服外源性生長(zhǎng)因子半衰期短、生物活性低、易降解的缺點(diǎn)，現(xiàn)多將基因工程與牙周組織工程相結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段誘導(dǎo)表達(dá)分泌型生長(zhǎng)因子，在局部造成生長(zhǎng)因子適當(dāng)表達(dá)并持續(xù)一段時(shí)間，為利用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)牙周組織再生開(kāi)拓了新的前景。本研究擬將人骨形成蛋白2真核表迭載體PCDNA31B2轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細(xì)胞系細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞，建立能穩(wěn)定表達(dá)BMP2的細(xì)胞系，并利用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)TRANSWELL，觀察轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)的分泌型BMP2對(duì)NIH3T3細(xì)胞骨化分化的影響。以探討B(tài)MP2基因治療在牙周組織工程方面的意義。實(shí)驗(yàn)一PCDNA31B2真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定及穩(wěn)定表達(dá)BMP2細(xì)胞系的建立目的通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立穩(wěn)定表迭BMP2的成纖維細(xì)胞系。材料和方法將PCDNA31B2用ECORI和XOAI雙酶切后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并檢測(cè)其攜帶目的基因的核酸序列。將經(jīng)過(guò)鑒定的PCDNA31B2真核表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)高效的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞中，并用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。RTPCR和酶聯(lián)免

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多不同力學(xué)環(huán)境對(duì)兔松質(zhì)骨骨折愈合中bFGF表達(dá)的影響.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：工農(nóng)業(yè)、交通運(yùn)輸和生產(chǎn)建設(shè)的發(fā)展，使得各種各樣的開(kāi)放性外傷、骨缺損患者日漸增多，在臨床上大段骨缺損及外傷后感染的治療成為一個(gè)非常棘手的問(wèn)題，且外傷后組織感染極大的影響骨缺損的修復(fù)。隨著海洋事業(yè)的發(fā)展及未來(lái)臺(tái)海軍事斗爭(zhēng)衛(wèi)勤保障的需要，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于海水浸泡的組織損傷研究也越來(lái)越多，但對(duì)肢體大段骨缺損海水浸泡感染后的修復(fù)與功能重建的研究較少，且海水浸泡大段肢體骨缺損感染動(dòng)物模型的制備也無(wú)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在此背景下，特至福建沿海某特定海域開(kāi)展開(kāi)放外傷海水浸泡感染后大段骨缺損材料修復(fù)的對(duì)比研究。首先開(kāi)展開(kāi)放性外傷骨缺損海水浸泡并感染的動(dòng)物模型制備，并且采用現(xiàn)階段臨床使用最多的二種人工替代材料修復(fù)骨缺損進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究。本研究目的主要是對(duì)比海水浸泡與陸地自然暴露感染后軟組織修復(fù)情況及材料修復(fù)大段骨缺損的效果，為未來(lái)海洋事業(yè)及軍事斗爭(zhēng)衛(wèi)勤保障提供支持。本研究共進(jìn)行了以下四個(gè)方面工作一、首創(chuàng)開(kāi)放肢體大段骨缺損海水浸泡并感染的動(dòng)物犬模型的制備，取雌雄不限犬，重10～15KG，麻醉后取前小腿橈骨，于橈骨中段部分制成2厘米長(zhǎng)開(kāi)放性骨缺損，海水浸泡致傷肢骨缺損感染，完成肢體骨缺損海水浸泡并感染的動(dòng)物模型。二、開(kāi)展了福建某特定海域肢體開(kāi)放性外傷海水浸泡后感染的細(xì)菌及其對(duì)抗生素敏感程度的初步調(diào)查。試驗(yàn)組特定海域海水浸泡，對(duì)照組傷口自然暴露，各2小時(shí)，再將傷口無(wú)菌包扎，3天后觀察傷口情況，取分泌物細(xì)菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn)，確定感染。并進(jìn)行抗生素藥物敏感試驗(yàn)，優(yōu)選有效抗生素治療骨缺損并感染的動(dòng)物，指導(dǎo)開(kāi)放性外傷海水浸泡后細(xì)菌感染臨床抗生素的經(jīng)驗(yàn)性早期使用，為開(kāi)放性外傷海水浸泡后感染的治療贏得保貴時(shí)間。三、通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，觀察海水浸泡后感染對(duì)傷肢骨缺損周邊皮膚軟組織修復(fù)情況的影響。觀察骨缺損海水浸泡并感染后傷口皮膚愈合、深部軟組織修復(fù)及材料置入的穩(wěn)固性。采用四格表進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，卡方檢驗(yàn)，分析所得試驗(yàn)組傷口愈合效果及材料穩(wěn)固性都差于對(duì)照組。四、進(jìn)行人工替代材料置入修復(fù)感染后骨缺損的效果對(duì)比研究。二期所有骨缺損海水浸泡感染后動(dòng)物隨機(jī)分組，分別以納米羥基磷灰石NANOHYDROXYAPATITE，NHA復(fù)合材料骨段植入及CPC凝固體（自固化磷酸鈣CALCIUMPHOSPHATECEMENT，CPC）植入。術(shù)后12周分別行X線攝片，取斷端骨組織病理學(xué)觀察，軟組織以HE染色，骨標(biāo)本固定VG染色。通過(guò)X線片及病理切片觀察骨折斷端與材料間肉芽組織、纖維組織、軟骨骨痂和新骨增生情況，給予行軟組織病理評(píng)級(jí)，并給予骨斷端骨痂生長(zhǎng)情況分級(jí)。采用析因分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，分析所得術(shù)后12周試驗(yàn)組與對(duì)照組間以及納米復(fù)合骨與CPC間軟組織病理結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P005。臨床結(jié)果顯示根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果可見(jiàn)海水中特有弧菌菌群，致病性強(qiáng)，通過(guò)大體標(biāo)本愈合情況觀察，海水浸泡組傷口皮膚及軟組織愈合差于自然暴露組；組織病理學(xué)愈合等級(jí)對(duì)比，試驗(yàn)組愈合效果差于對(duì)照組，材料修復(fù)方面CPC凝固體降解可，新生骨長(zhǎng)入效果好于納米骨；骨痂生長(zhǎng)情況同樣顯示試驗(yàn)組生長(zhǎng)量差于對(duì)照組，CPC材料誘導(dǎo)成骨明顯好于納米骨。分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得到以下結(jié)論通過(guò)研究肯定了弧菌屬致病性強(qiáng)，海水浸泡后危害性大，致感染后嚴(yán)重影響傷口愈合，通過(guò)藥物敏感試驗(yàn)可知，環(huán)丙沙星、青霉素、左氧氟沙星對(duì)球菌、桿菌及弧菌均有較高的敏感率，在藥敏結(jié)果出來(lái)之前，可以列為經(jīng)驗(yàn)性用藥常規(guī)使用；海水浸泡開(kāi)放骨缺損感染后人工材料修復(fù)差；開(kāi)放骨缺損海水浸泡感染后CPC凝固體植入較納米材料骨植入修復(fù)效果好。目前廣泛應(yīng)用的二種替代材料中，CPC修復(fù)及促骨生長(zhǎng)效果較好，為將來(lái)在骨缺損中對(duì)于材料骨的選擇有一定借鑒作用。且我們率先制備的海水浸泡肢體開(kāi)放骨缺損并感染的動(dòng)物模型，值得推廣。

簡(jiǎn)介：目的了解骨替代材料在人體內(nèi)的生物學(xué)變化。探討灌注培養(yǎng)法構(gòu)建大段組織工程化骨修復(fù)羊脛骨節(jié)段性骨缺損的可行性。方法對(duì)43例人體的骨替代材料活檢標(biāo)本行硬組織切片檢查，觀察植入?yún)^(qū)的新生組織、材料的形態(tài)改變、降解顆粒及伴隨的細(xì)胞反應(yīng)。對(duì)復(fù)合羊骨髓基質(zhì)干細(xì)胞BMSCS的大段多孔磷酸三鈣PTCP載體進(jìn)行傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)和利用灌注型生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)，通過(guò)葡萄糖日耗量、細(xì)胞活力檢測(cè)、電鏡以及硬組織切片觀察，比較兩種培養(yǎng)對(duì)干細(xì)胞在載體內(nèi)分布的影響。同時(shí)建立載體隨機(jī)孔道結(jié)構(gòu)的流體分析模型，通過(guò)載體內(nèi)流速和剪切應(yīng)力的分布探討細(xì)胞分布的機(jī)理。將構(gòu)建的組織工程化骨植入羊脛骨中段骨缺損，通過(guò)影像學(xué)和組織學(xué)檢查觀察骨缺損的修復(fù)效果。結(jié)果鈣磷陶瓷周?chē)蛢?nèi)部形成了數(shù)量不等的新骨，其中羥基磷灰石HA、煅燒骨、雙相鈣磷陶瓷形態(tài)基本完整，而ΒTCP的結(jié)構(gòu)變得疏松。陶瓷周?chē)梢?jiàn)降解顆粒，一些顆粒位于多核巨細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)研究中葡萄糖日耗量和細(xì)胞活力隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組的葡萄糖日耗量和細(xì)胞活力明顯大于靜態(tài)培養(yǎng)組。培養(yǎng)前2周葡萄糖日耗量較后2周增加更迅速。動(dòng)態(tài)培養(yǎng)4周時(shí)細(xì)胞活力高于2周PO05。計(jì)算流體力學(xué)分析顯示流體能流到的部位幾乎都有細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)較快的部位流速大多集中在02～06MM／S，剪切力大多集中在00050～0025PA，在羊脛骨中段3CM長(zhǎng)的骨缺損中分別植入ΒTCP、靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程化骨，16周后ΒTCP組無(wú)一例愈合O／5，靜態(tài)培養(yǎng)組1例愈合1／5，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組4例愈合4／5。各組ΒTCP載體的原有結(jié)構(gòu)消失，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組的材料殘余量明顯低于其它兩組。結(jié)論鈣磷陶瓷具有良好的骨傳導(dǎo)作用。HA、煅燒骨、雙相鈣磷陶瓷在人體內(nèi)降解緩慢，而ΒTCP則降解較快，陶瓷降解時(shí)產(chǎn)生降解顆粒并引起細(xì)胞吞噬反應(yīng)。ΒTCP在人體內(nèi)的降解速度慢于動(dòng)物。灌注型生物反應(yīng)器能確保大段多孔ΒTCP載體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和氣體交換，使BMSCS在載體內(nèi)存活并增殖，提高細(xì)胞的復(fù)合效率，構(gòu)建的組織工程化骨可修復(fù)長(zhǎng)骨的節(jié)段性骨缺損。

簡(jiǎn)介：研究背景和目的嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因所致的骨缺損是臨床常見(jiàn)的疑難問(wèn)題，骨組織工程被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損的理想方法，在將來(lái)的臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。種子細(xì)胞作為骨組織工程的最重要環(huán)節(jié)之一，近年來(lái)進(jìn)行了大量的研究，一般認(rèn)為，理想的骨組織工程種子細(xì)胞需要滿足三個(gè)基本條件①可靠的細(xì)胞來(lái)源，取材方便，易于體外擴(kuò)增；②具有特定的分化表型或定向分化潛能；③能夠適應(yīng)受區(qū)環(huán)境，組織相容性好，不引發(fā)移植排斥反應(yīng)。目前可用于骨組織工程的種子細(xì)胞主要包括成骨細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。其中成骨細(xì)胞是成體終末細(xì)胞，增殖潛能有限，來(lái)源困難。胚胎干細(xì)胞則受到倫理學(xué)的限制，成骨分化的調(diào)控機(jī)制也較為復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)方法1采用PERCOLL密度梯度離心法從健康成人骨髓中分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；DMEMF1210％FBS常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至80％100％融合時(shí)以13傳代；FACS檢測(cè)第3代細(xì)胞的CD105、CD34表達(dá)。2HTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和鑒定用質(zhì)粒提取試劑盒從DH5Α大腸桿菌中分別提取PGRN145質(zhì)粒和PLXSN質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶ECⅠ酶切鑒定。3HTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和病毒滴度的測(cè)定，用質(zhì)粒提取試劑盒提取新構(gòu)建的PLXSNHTERT重組質(zhì)粒，測(cè)定濃度，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞，應(yīng)用G418抗性，克隆環(huán)和有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆。用3T3細(xì)胞按常規(guī)方法測(cè)定病毒滴度。選擇滴度最高的PT67細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。4HTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HMSCS細(xì)胞，將病毒滴度最高的HTERTPT67克隆細(xì)胞用絲裂霉素處理，與第2代HMSCS共培養(yǎng)以感染HMSCS，應(yīng)用G418篩選出抗性細(xì)胞群HTERTHMSCS。5免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)HTERTHMSCS細(xì)胞中HTERT蛋白表達(dá)，以HMSCS為對(duì)照。6端粒酶活性檢測(cè)試劑盒TRAPEZETELOMERASEDETECTIONKIT檢測(cè)HTERTHMSCS端粒酶活性，以HMSCS為對(duì)照。7CTLA4IG重組腺病毒ADVCTLA4IGEGFP直接感染HMSCS和HTERTHMSCS。倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。8免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CTLA4IGHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS細(xì)胞中CTLA4IG蛋白表達(dá)。WESTERNBLOTTING檢測(cè)CTLA4IGHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS細(xì)胞培養(yǎng)液中CTLA4IG蛋白。9用倒置光學(xué)顯微鏡觀察HMSCS、CTLA4IGHMSCS、HTERTHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS的形態(tài)及其生長(zhǎng)情況。10FACS測(cè)定HMSCS、CTLA4IGHMSCS、HTERTHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS的細(xì)胞周期。11用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基含地塞米松、維生素C和ΒGP的DMEMF12進(jìn)行。CTLA4IGHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后進(jìn)行成骨特異性標(biāo)志檢測(cè)。12組織工程骨構(gòu)建采用單向接種法將成骨誘導(dǎo)1周的CTLA4IGHMSCS和HMSCS接種到脫鈣骨基質(zhì)DBM上，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后應(yīng)用，用前計(jì)算單位重量DBM所吸附的細(xì)胞數(shù)量。13CTLA4IGHMSCS和HMSCS細(xì)胞成骨動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組新西蘭大白兔20只，雌雄不限，體重2535千克，隨機(jī)分為4組，A組DBMCTLA4IGHMSCS，B組DBMHMSCS，C組DBM，D組空白。每組5只，采用兔橈骨缺損動(dòng)物模型進(jìn)行骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)。術(shù)后2天、2周、4周、8周、12周進(jìn)行X線攝片觀察骨缺損部位成骨修復(fù)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1分離培養(yǎng)的原代HMSCS呈紡錘形或三角形，類(lèi)似纖維細(xì)胞，旋渦樣排列；第3代細(xì)胞FACS檢測(cè)結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞908％表達(dá)CD105表達(dá)，962％CD34為陰性。證明該細(xì)胞為高純度的HMSCS。2PGRN145質(zhì)粒用ECⅠ單酶切獲得一條115KB的載體片斷和一條35KB的HTERT目的片斷；PLXSN質(zhì)粒ECⅠ單酶切獲得一條59KB的線性片斷，將回收純化的HTERT和線形化PLXSNDNA片段經(jīng)過(guò)連接，轉(zhuǎn)化和酶切鑒定，獲得PLXSNHTERT重組質(zhì)粒。3PLXSNHTERT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PT67細(xì)胞經(jīng)過(guò)G418抗性篩選獲得產(chǎn)病毒HTERTPT67包裝細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒液病毒滴度為12104。4PLXSNHTERTPT67包裝細(xì)胞與HMSCS共培養(yǎng)5天，G418抗性篩選30天。存活細(xì)胞命名為HTERTHMSCS。細(xì)胞培養(yǎng)至第46代，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，生長(zhǎng)良好。5HTERTHMSCS和HMSCS細(xì)胞HTERT免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞HTERT蛋白陽(yáng)性表達(dá)均在細(xì)胞核，HTERTHMSCS細(xì)胞核全部深染，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野陽(yáng)性率99％，HMSCS陽(yáng)性率65％。6端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，HMSCS細(xì)胞有50BP端粒酶活性產(chǎn)物條帶，但未形成6堿基梯度遞增條帶，HTERTHMSCS細(xì)胞TRAP產(chǎn)物擴(kuò)增梯度遞增條帶50BP、56BP、62BP、68BP、74BP等明顯可見(jiàn)。說(shuō)明未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HMSCS有低水平的端粒酶活性。經(jīng)HTERT基因轉(zhuǎn)染的HMSCS，即HTERTHMSCS細(xì)胞端粒酶活性明顯增強(qiáng)。7CTLA4IG重組腺病毒ADVCTLA4IGEGFP感染HMSCS后48小時(shí)，感染HTERTHMSCS后24小時(shí)可見(jiàn)少量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，隨后逐漸增多，兩種細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)高峰均在第5天，第28天綠色熒光開(kāi)始減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，HMSCS感染率為8114％，HTERTHMSCS感染率為8375％。8免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，大多數(shù)CTLA4IGHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS在胞漿中可見(jiàn)CTLA4IG蛋白陽(yáng)性表達(dá)，核周?chē)蠲黠@。9細(xì)胞形態(tài)觀察可見(jiàn)HMSCS、CTLA4IGHMSCS、HTERTHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS均以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主，有少量細(xì)胞呈三角形。隨著細(xì)胞的多次傳代，HMSCS逐漸變寬變短，生長(zhǎng)變慢。而HTERTHMSCS保持長(zhǎng)梭形，突起增多，三角形和多角形的細(xì)胞稍增多。生長(zhǎng)速度無(wú)明顯改變。10細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果112代HMSCSG0G1逐漸增多G2M和S期細(xì)胞逐漸減少，統(tǒng)計(jì)分析相差顯著。說(shuō)明細(xì)胞增殖能力逐漸減弱；118代HTERTHMSCSG0G1細(xì)胞雖然也顯示逐漸增多G2M和S期細(xì)胞逐漸減少，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示無(wú)明顯差異，說(shuō)明HTERTHMSCS增殖能力沒(méi)有隨著傳代次數(shù)的增加而明顯減弱。11CTLA4IGHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，前2周細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速度無(wú)明顯改變；2周后細(xì)胞逐漸變寬變短，多角形細(xì)胞增多，細(xì)胞有聚集成團(tuán)的趨勢(shì)，第34周時(shí)大多數(shù)細(xì)胞為多角形且聚集成團(tuán)。12本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的組織工程骨，每克DBM上吸附、生長(zhǎng)的細(xì)胞約5105個(gè)。13CTLA4IGHMSCS異種動(dòng)物移植DBMCTLA4IGHMSCS組在術(shù)后2周、4周骨缺損處呈現(xiàn)低密度云霧影，8周時(shí)呈高密度影，與骨組織相似，12周可見(jiàn)完全骨化，髓腔再通。DBMMSCS組前4周和DBMCTLA4IGHMSCS組相似，但8周時(shí)缺損處密度明顯低于DBMMSCSC組，12周骨缺損仍未完全愈合。DBM組早期有云霧狀影，隨后逐漸消失。DBM組和空白組在觀察全程骨缺損逐漸縮小，但在術(shù)后12周仍留有明顯的骨缺損。結(jié)論1成功構(gòu)建了HTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLXSNHTERT。2篩選獲得了能夠產(chǎn)生HTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系HTERTPT67。3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的HTERT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)HMSCS細(xì)胞HTERTHMSCS，與HMSCS細(xì)胞相比，端粒酶活性明顯增強(qiáng)，增殖能力提高，生命周期延長(zhǎng)。4CTLA4IG基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的HMSCSCTLA4IGHMSCS和HTERT與CTLA4IG雙基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的HMSCSCTLA4IGHTERTHMSCS均可表達(dá)和分泌CTLA4IG蛋白。表達(dá)持續(xù)時(shí)間在4周以上。5腺病毒介導(dǎo)的CTLA4IG基因轉(zhuǎn)染HMSCS和HTERTHMSCS可使細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度變慢。6CTLA4IGHMSCS和CTLA4IGHTERTHMSCS均能夠在體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。說(shuō)明腺病毒介導(dǎo)的CTLA4IG基因轉(zhuǎn)染使HMSCS保持了成骨分化潛能。7用CTLA4IGHMSCS作為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨在異種移植動(dòng)物體內(nèi)成骨效果優(yōu)于HMSCS。CTLA4IGHTERTHMSCS在異種移植動(dòng)物體內(nèi)成骨效果有待于進(jìn)一步研究。

簡(jiǎn)介：背景與研究目的逼尿肌不穩(wěn)定DI是泌尿外科最常見(jiàn)的一種膀胱功能障礙性疾病，發(fā)生率極高，主要表現(xiàn)為儲(chǔ)尿期膀胱逼尿肌出現(xiàn)無(wú)抑制性收縮，常引起尿頻、尿急、尿失禁等臨床癥狀。目前發(fā)病原因不明，臨床治療效果不理想。因此，對(duì)逼尿肌的功能調(diào)節(jié)以及DI的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究顯得尤為必要。DI產(chǎn)生的常見(jiàn)原因?yàn)榘螂琢鞒龅拦Ｗ?、神?jīng)源性病變及特發(fā)性因素。發(fā)病機(jī)理尚不清楚，近年來(lái)在研究逼尿肌不穩(wěn)定的發(fā)病機(jī)理方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，主要有神經(jīng)源性和肌源性兩種假說(shuō)。最近資料顯示DI與逼尿肌自發(fā)興奮能力增強(qiáng)有關(guān)，發(fā)生DI的最終環(huán)節(jié)是肌細(xì)胞的興奮性增高，是一種肌源性興奮性改變。逼尿肌細(xì)胞是一種可興奮細(xì)胞，其興奮的產(chǎn)生受多種因素調(diào)控，CA2在其中起著最關(guān)鍵的作用；逼尿肌細(xì)胞興奮的前提是CA2內(nèi)流入胞，導(dǎo)致膜電位發(fā)生改變，使電壓依賴式離子通道激活，細(xì)胞去極化；同時(shí)，CA2發(fā)揮第二信使作用，激活其它CA2依賴式離子通道與受體，共同參與細(xì)胞動(dòng)作電位的引發(fā)。CA2通道是CA2入胞的主要途徑，逼尿肌細(xì)胞膜上有高密度的L型和T型CA2通道，逼尿肌不穩(wěn)定發(fā)病是否與不同類(lèi)型CA2通道的功能變化有關(guān)，有待深入研究。本研究目的在于通過(guò)體外肌條拉力和逼尿肌肌電活動(dòng)實(shí)驗(yàn)，觀察L、T型鈣通道阻滯劑對(duì)正常和不穩(wěn)定逼尿肌的作用，對(duì)比不同原因?qū)е卤颇蚣〔环€(wěn)定模型下逼尿肌自身功能特性的變化及其對(duì)L、T型鈣通道阻滯劑的反應(yīng)，初步探討鈣通道的功能變化在逼尿肌不穩(wěn)定發(fā)病機(jī)制中的重要作用以及不同致病因素引起的DI是否有相似的肌源性改變。材料及方法建立特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定IDI、膀胱流出道梗阻BOO和骶髓上脊髓損害SCI三種逼尿肌不穩(wěn)定大鼠模型，通過(guò)離體逼尿肌條實(shí)驗(yàn)和充盈性膀胱測(cè)壓觀察正常和不穩(wěn)定逼尿肌的興奮性、自律性、收縮力變化以及對(duì)L型鈣通道阻滯劑NIFEDIPINE和T型鈣通道阻滯劑NICL2的反應(yīng)；觀察L、T型鈣通道阻滯劑對(duì)離體和在體膀胱逼尿肌肌電活動(dòng)和收縮性能的影響；同時(shí)對(duì)比三種DI模型下不穩(wěn)定逼尿肌的功能改變有無(wú)異同。結(jié)果1充盈性膀胱測(cè)壓結(jié)果顯示DIBOO，DISCI和IDI發(fā)生率依次為755％，100％，214％。2與正常對(duì)照組相比，BOO、SCI和IDI組離體逼尿肌條的興奮性、自發(fā)性收縮頻率及收縮力均明顯增強(qiáng)，而各DI模型組間相比無(wú)顯著性差異；L型鈣通道阻滯劑NIFEDIPINE和T型鈣通道阻滯劑NICL2對(duì)正常對(duì)照組和DI組逼尿肌條的自律性和收縮力均有明顯的抑制作用，其中對(duì)正常組作用更明顯。3在正常對(duì)照組和各DI模型組中，NIFEDIPINE和NICL2都可抑制離體逼尿肌的自發(fā)性收縮和肌電活動(dòng)，其中NICL2對(duì)各組離體逼尿肌條肌電活動(dòng)的抑制作用明顯強(qiáng)于NIFEDIPINE。4NIFEDIPINE和NICL2均能不同程度改善在體膀胱逼尿肌無(wú)抑制性收縮和降低膀胱肌電活動(dòng)的爆發(fā)波頻率，而后者對(duì)肌電活動(dòng)抑制作用更明顯。結(jié)論1成功建立了常見(jiàn)原因?qū)е碌拇笫蟊颇蚣〔环€(wěn)定模型。2不同原因?qū)е碌腄I在逼尿肌自身功能改變和對(duì)鈣通道阻滯劑的反應(yīng)上表現(xiàn)出很大的相似性，提示肌源性因素在逼尿肌發(fā)病中有重要作用。3L型、T型鈣通道阻滯劑對(duì)各不穩(wěn)定逼尿肌的作用均不及正常逼尿肌明顯，提示逼尿肌細(xì)胞鈣通道的功能改變可能與DI的發(fā)生密切相關(guān)。4L型、T型鈣通道阻滯劑均可抑制逼尿肌的自發(fā)性收縮和肌電活動(dòng)，但L型鈣通道阻滯劑僅僅抑制了收縮，并未消除電活動(dòng)；而T型鈣通道阻滯劑可消除自發(fā)收縮和逼尿肌電活動(dòng)，這一發(fā)現(xiàn)為我們更好的應(yīng)用鈣通道阻滯劑治療DI提供了新的思路和依據(jù)。

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簡(jiǎn)介：背景肩關(guān)節(jié)假體設(shè)計(jì)從第一代整體型假體到第四代三維解剖型假體發(fā)展迅速，第四代假體設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)是肩關(guān)節(jié)骨性結(jié)構(gòu)的精確測(cè)量，現(xiàn)有各種測(cè)量方法測(cè)值差異大，缺點(diǎn)明顯，其臨床應(yīng)用受到限制。因此，探索多層螺旋CT后處理技術(shù)測(cè)量盂肱關(guān)節(jié)骨性結(jié)構(gòu)的方法具有重要意義。目的探討MSCT后處理技術(shù)測(cè)量盂肱關(guān)節(jié)骨性結(jié)構(gòu)的方法及其初步運(yùn)用，為國(guó)人肩關(guān)節(jié)假體設(shè)計(jì)提供部分參考數(shù)據(jù)。方法51根中國(guó)成人干肱骨標(biāo)本，其中右側(cè)23根，左側(cè)28根。50個(gè)中國(guó)成人肩胛骨干標(biāo)本，其中右側(cè)26個(gè)，左側(cè)24個(gè)。50個(gè)中國(guó)成人肩關(guān)節(jié)防腐濕標(biāo)本，其中右側(cè)21個(gè)、左側(cè)29個(gè)。使用SIEMENSSOMATOMSENSATION16多層螺旋CT掃描儀。圖像傳送到LEONARDO工作站行多平面重組及容積再現(xiàn)技術(shù)處理。MPR和VRT測(cè)量肱骨側(cè)指標(biāo)1頭扭轉(zhuǎn)角；2斜傾角3頭偏心距向后的偏心距及向內(nèi)的偏心距；4頭關(guān)節(jié)面直徑5頭曲率半徑6頭高7頭頂結(jié)節(jié)距；8頭關(guān)節(jié)面張角；9髓腔寬度指標(biāo)外科頸平面髓腔寬度，外科頸下方20MM平面髓腔寬度，外科頸下方40MM平面髓腔寬度，外科頸下方60MM平面髓腔寬度，外科頸下方80MM平面髓腔寬度，肱骨近中段130MM平面髓腔寬度；10髓腔張口變化指標(biāo)FV1，F(xiàn)V2，F(xiàn)V3，F(xiàn)V4，F(xiàn)V5；11肱骨縱軸全長(zhǎng)；12肱骨近中段圓柱體長(zhǎng)度。盂側(cè)指標(biāo)1盂斜傾角；2盂扭轉(zhuǎn)角；3盂上下最大徑；4盂上下曲率半徑；5盂前后最大徑；6盂前后曲率半徑；7盂窩深度；8盂窩后松質(zhì)骨深度；9盂窩后1厘米處松質(zhì)骨寬度。盂肱關(guān)系指標(biāo)嵌合匹配指數(shù)。用MPR和VRT測(cè)量肱骨側(cè)不同位置指標(biāo)64項(xiàng)，MPR測(cè)量肩胛盂指標(biāo)21項(xiàng)，盂肱關(guān)系指標(biāo)4項(xiàng)。并行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果1肱骨側(cè)1肱骨冠狀位、矢狀位各指標(biāo)VRT測(cè)量與厚層MPR測(cè)量值配對(duì)T檢驗(yàn)提示冠狀位頭關(guān)節(jié)面直徑、冠狀位頭曲率半徑、肱骨縱軸全長(zhǎng)三個(gè)指標(biāo)VRT和厚層MPR兩種方法測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著P＜005。說(shuō)明不同的測(cè)量方法對(duì)該三項(xiàng)指標(biāo)測(cè)值有影響。而其余10個(gè)指標(biāo)，兩種測(cè)量方法統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著P＞005。2肱骨軸位指標(biāo)薄層MPR、厚層MPR及VRT測(cè)量值方差分析提示干肱骨標(biāo)本頭高三種測(cè)量方法統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著P＜005，說(shuō)明干肱骨標(biāo)本軸位頭高VRT測(cè)量和MPR測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。而其余四個(gè)指標(biāo)頭扭轉(zhuǎn)角、頭曲率半徑、頭關(guān)節(jié)面張角、頭關(guān)節(jié)面直徑三種測(cè)量方法統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著P＞005。351個(gè)干肱骨標(biāo)本、50個(gè)防腐肩關(guān)節(jié)中濕肱骨標(biāo)本各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)值獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)提示軸位厚層MPR頭關(guān)節(jié)面直徑、軸位VRT頭高、冠狀位VRT頭高、矢狀位VRT頭高、矢狀位VRT頭關(guān)節(jié)面直徑、矢狀位VRT頭曲率半徑、冠狀位VRT頭關(guān)節(jié)面張角、矢狀位VRT頭關(guān)節(jié)面張角、矢狀位厚層MPR頭高、冠狀位厚層MPR頭頂結(jié)節(jié)距、矢狀位厚層MPR頭關(guān)節(jié)面張角、冠狀位厚層MPRPOSN60髓腔寬度、矢狀位厚層MPRPOSN髓腔寬度、矢狀位厚層MPR張口變化1等指標(biāo)干、濕肱骨標(biāo)本測(cè)值統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著P＜005。而其余指標(biāo)測(cè)值干、濕標(biāo)本統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著P＞005。4肱骨側(cè)指標(biāo)測(cè)值情況MPR冠狀位、矢狀位各指標(biāo)均值比較，除頭關(guān)節(jié)面張角冠狀位測(cè)值小于矢狀位及FV5冠狀位測(cè)值等于矢狀位外，其余指標(biāo)均為冠狀位測(cè)值大于矢狀位。VRT冠狀位、矢狀位各指標(biāo)均值比較，除頭關(guān)節(jié)面張角冠狀位測(cè)值小于矢狀位外，其余指標(biāo)冠狀位測(cè)值大于矢狀位。軸位頭關(guān)節(jié)面直徑、軸位頭曲率半徑小于冠狀位測(cè)值，軸位頭關(guān)節(jié)面張角大于矢狀位，且大于冠狀位測(cè)值。各項(xiàng)指標(biāo)變異程度不同，如肱骨頭扭轉(zhuǎn)角變異較大33°～570°。髓腔寬度變化肱骨近中段各平面髓腔寬度，均為冠狀位測(cè)值大于矢狀位，以肱骨近中段130MM平面冠狀位和矢狀位髓腔寬度差別最小，近似圓形，其余為橢圓形。髓腔張口變化以FV1最大最明顯，F(xiàn)V2次之，從FV3到FV5冠狀位和矢狀位非常接近。5肱骨側(cè)干標(biāo)本、濕標(biāo)本指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著的部分指標(biāo)樣本量為101者進(jìn)行相關(guān)分析及繪制散點(diǎn)圖，結(jié)果指標(biāo)間相關(guān)顯著性不一。2盂側(cè)1盂側(cè)指標(biāo)厚層MPR與薄層MPR測(cè)量值配對(duì)T檢驗(yàn)提示盂前后曲率半徑、盂扭轉(zhuǎn)角、軸位盂窩深度、軸位盂窩后松質(zhì)骨深度該四項(xiàng)指標(biāo)厚層MPR和薄層MPR測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著P＞005，即該四項(xiàng)指標(biāo)取值兩種測(cè)量方法都可以，沒(méi)有差別。而盂上下最大徑、盂上下曲率半徑、盂前后最大徑、冠狀位盂窩深度、軸位盂窩后1CM松質(zhì)骨寬度該五項(xiàng)指標(biāo)厚層MPR和薄層MPR測(cè)量統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著P＜005，即該五項(xiàng)指標(biāo)取值與使用何種測(cè)量方法有關(guān)，與是否為厚層MPR、薄層MPR有關(guān)。2肩胛骨干、濕標(biāo)本各項(xiàng)指標(biāo)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)提示盂前后曲率半徑、薄層MPR盂前后最大徑、盂扭轉(zhuǎn)角、盂上下曲率半徑、盂斜傾角、厚層MPR冠狀位盂窩深度、薄層MPR冠狀位盂窩后1厘米松質(zhì)骨寬度肩胛骨干、濕標(biāo)本測(cè)值統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著P＜005。對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)時(shí)，需區(qū)分肩胛骨干、濕標(biāo)本測(cè)值，而其余指標(biāo)則合并樣本量為100進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。3盂側(cè)各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)量值比較各項(xiàng)指標(biāo)均值，盂前后曲率半徑、薄層MPR盂前后最大徑、盂上下曲率半徑、厚層MPR盂斜傾角四項(xiàng)指標(biāo)肩胛骨干標(biāo)本測(cè)值均小于肩胛骨濕標(biāo)本。而厚層MPR冠狀位盂窩深度、薄層MPR盂窩后1厘米松質(zhì)骨寬度兩項(xiàng)指標(biāo)肩胛骨干標(biāo)本測(cè)值大于肩胛骨濕標(biāo)本。盂扭轉(zhuǎn)角肩胛骨干、濕標(biāo)本測(cè)值差異很大，濕標(biāo)本盂扭轉(zhuǎn)角30°27°較干標(biāo)本盂扭轉(zhuǎn)角04°034°更呈后傾。而其余指標(biāo)干、濕肩胛骨標(biāo)本合并樣本量為100，厚層MPR與薄層MRP測(cè)值差異不大。4盂側(cè)指標(biāo)相關(guān)分析對(duì)肩胛骨干、濕標(biāo)本指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)后，再對(duì)干、濕標(biāo)本統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著的指標(biāo)合并樣本量為100后進(jìn)行相關(guān)分析及繪制散點(diǎn)圖結(jié)果指標(biāo)間相關(guān)顯著性不一。3得出各指標(biāo)均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最大值、最小值，并與國(guó)內(nèi)、國(guó)外相應(yīng)指標(biāo)測(cè)值對(duì)比。本實(shí)驗(yàn)肱骨縱軸長(zhǎng)、冠狀位頭曲率半徑、冠狀位頭高、向內(nèi)側(cè)偏心距、頭頂結(jié)節(jié)距、冠狀位頭關(guān)節(jié)面張角、盂肱嵌合指數(shù)等指標(biāo)測(cè)值均小于西方人，而向后側(cè)偏心距、頭斜傾角、盂斜傾角、盂上下曲率半徑大于西方人。結(jié)論1通過(guò)本實(shí)驗(yàn)初步建立MSCT后處理技術(shù)測(cè)量盂肱關(guān)節(jié)骨性結(jié)構(gòu)的測(cè)量方法，并證明MPRVRT是測(cè)量盂肱關(guān)節(jié)骨性結(jié)構(gòu)較好的方法。肱骨側(cè)數(shù)據(jù)建議用VRT測(cè)量。2國(guó)人盂肱關(guān)節(jié)骨性結(jié)構(gòu)解剖數(shù)據(jù)有不同程度變異，與西方人存在明顯的差異，因此肩關(guān)節(jié)假體設(shè)計(jì)時(shí)需尺寸規(guī)格多樣化。

簡(jiǎn)介：目的研究環(huán)氧合酶2（CYCLOOXYGENASE2，COX2）對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（BONEMPHOGEICPROTEIN9，BMP9）誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS成骨分化的影響及其影響的可能機(jī)制。方法本課題采用組織化學(xué)染色及化學(xué)發(fā)光法實(shí)驗(yàn)、鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)、WESTERNBLOT和PCR實(shí)驗(yàn)，研究COX2對(duì)BMP9誘導(dǎo)MSCS成骨分化的影響及其影響的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)具體步驟如下1通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)COX2選擇性抑制劑對(duì)BMP9誘導(dǎo)MSCS成骨分化的影響。2通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在BMP9和或BMP9合并外源性過(guò)表達(dá)或沉默COX2情況下，對(duì)BMP9誘導(dǎo)MSCS成骨分化的影響。3通過(guò)體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)COX2不同表達(dá)狀態(tài)對(duì)BMP9誘導(dǎo)MSCS異位成骨能力的影響。4通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，分析COX2對(duì)BMP9誘導(dǎo)MSCS的BMPSSMADS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。結(jié)果1抑制COX2的酶活性或沉默表達(dá)COX2，均能明顯抑制BMP9誘導(dǎo)MSCS成骨分化。外源性過(guò)表達(dá)COX2明顯增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCS成骨分化。2抑制COX2的酶活性或沉默表達(dá)COX2，均能明顯抑制BMP9誘導(dǎo)重要成骨分化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在MSCS中的表達(dá)，而外源性過(guò)表達(dá)COX2增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)這些成骨分化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在MSCS中的表。3外源性過(guò)表達(dá)COX2增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)MSCS異位成骨能力，而沉默表達(dá)COX2則抑制BMP9誘導(dǎo)MSCS異位成骨能力。4COX2能增強(qiáng)BMP9在MSCS中激活的BMPSSMADS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)論COX2在BMP9誘導(dǎo)MSCS成骨分化過(guò)程中具有重要作用，這種作用可能至少與增強(qiáng)BMPSSMADS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

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簡(jiǎn)介：上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文新型趨骨性雌二醇促進(jìn)骨形成優(yōu)勢(shì)性能的評(píng)價(jià)姓名趙強(qiáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)指導(dǎo)教師鄧廉夫201104上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文結(jié)構(gòu)修飾方式將其與17P雌二醇EZ鍵合成一種具有趨骨特性的亞氨基二乙酸一雌二醇復(fù)合物SE。我們假設(shè)這種復(fù)合物在體內(nèi)可與骨結(jié)合，使雌激素的作用部位集中在骨內(nèi)。以這種方式補(bǔ)充雌激素不僅能有效防治骨質(zhì)疏松，而且還能降低對(duì)其他組織的副作用。其次，我們對(duì)HIF／VEGF通路能否有效減低雌激素喪失后的骨質(zhì)疏松進(jìn)行了觀察。骨改建與血管形成有密切關(guān)系。己知HIF／VEGF通路是骨和血管偶聯(lián)的關(guān)鍵調(diào)控因子，因此我們假設(shè)激發(fā)該通路可能降低雌激素缺乏引起的骨量丟失?！灸康摹?檢測(cè)亞氨基二乙酸一雌二醇復(fù)合物SE在骨和其他組織器官的分布狀況及活性。2探討SE。對(duì)卵巢切除大鼠的骨質(zhì)疏松以及骨質(zhì)疏松性骨折的治療作用。3利用卵巢切除的基因敲除小鼠觀察HIF／VEGF通路對(duì)雌激素缺乏所致的骨質(zhì)疏松有無(wú)抑制作用。【方法】1對(duì)6周齡雌性小鼠分別通過(guò)尾靜脈注射氫3標(biāo)記雌二醇3HE及氫3標(biāo)記亞氨基二乙酸一雌二醇復(fù)合物3HSE。給藥后1H、2H、4H、8H、12H、24H、3D、、5D、7D、LOD、14D分別測(cè)量各小鼠的血液、顱骨、股骨下端、L椎骨、肝臟、心臟、脾臟、子宮、卵巢等組織中的放射強(qiáng)度。此外，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)E和SE與成骨細(xì)胞雌激素受體的結(jié)合情況作了觀

簡(jiǎn)介：本研究分為三部分第一部分高脂飼養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌蛋白激酶B、底物AS160表達(dá)水平的調(diào)節(jié)及其在骨骼肌胰島素抵抗中的作用目的探討高脂飼養(yǎng)對(duì)大鼠胰島素敏感性的影響，觀察胰島素刺激的高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗大鼠骨骼肌蛋白激酶BAKTPKB及其底物磷酸化AS160的表達(dá)水平，體脂含量變化及其意義；探討PPARΓ受體激動(dòng)劑羅格列酮和AMPK激活劑二甲雙胍對(duì)高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗大鼠骨骼肌AKT及磷酸化AS160、GLUT4蛋白表達(dá)水平的影響，研究二者對(duì)骨骼肌胰島素敏感性的作用機(jī)制。方法雄性WISTAR大鼠分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)組大鼠均給予高脂飼料，即脂肪占總熱量比例為59％，主要為飽和脂肪酸的動(dòng)物脂肪。各組飼養(yǎng)12周，之后實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)為高脂組、羅格列酮組以劑量為3MGKGD和二二甲雙胍組300MGKGD分別灌胃干預(yù)8周，對(duì)照組仍然給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余組仍給高脂飲食。喂養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)大鼠體重和血糖水平，空腹血漿胰島素和血脂水平，及葡萄糖耐量試驗(yàn)，測(cè)定內(nèi)臟脂肪含量，評(píng)估胰島素敏感性，測(cè)定骨骼肌葡萄糖攝取率。應(yīng)用WESTERNBLOT檢測(cè)各組肌肉組織AKT及其底物AS160信號(hào)分子表達(dá)變化，檢測(cè)各組肌肉組織GLUT4蛋白表達(dá)變化，研究PPARΓ激動(dòng)劑羅格列酮和AMPKΑ激活劑二甲雙胍對(duì)高脂誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌胰島素抵抗的改善作用及其機(jī)制。結(jié)論高脂飲食可以誘導(dǎo)大鼠機(jī)體水平和骨骼肌水平的胰島素抵抗。高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠體脂進(jìn)行性增多可能降調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素信號(hào)通路中磷酸化AKTSER473的表達(dá)水平，升高骨骼肌磷酸化AS160的表達(dá)水平，同時(shí)其骨骼肌細(xì)胞膜GLUT4蛋白水平較對(duì)照組顯著降低，從而減少葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗。本研究提示大鼠骨骼肌磷酸化AKTSER473表達(dá)下調(diào)和大鼠骨骼肌磷酸化ASL60的表達(dá)上調(diào)可能是高脂誘導(dǎo)大鼠骨骼肌胰島素抵抗的下游機(jī)制。羅格列酮和二甲雙胍可能直接或間接通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素信號(hào)傳導(dǎo)即增加骨骼肌胰島素信號(hào)通路中磷酸化AKT的表達(dá)，降低骨骼肌磷酸化AS160的表達(dá)而改善胰島素的敏感性。第二部分AS160與1433蛋白在高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌細(xì)胞中相互作用目的探討在高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌內(nèi)胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4GLUT4移位中，磷酸化AS160是否和1433蛋白發(fā)生生理性的相互作用。方法高脂飼養(yǎng)脂肪占總熱量比例為59％，以飽和脂肪酸為主雄性WISTAR大鼠12周，喂養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)大鼠體重和血糖水平，空腹血漿胰島素和血脂水平，及葡萄糖耐量試驗(yàn)，測(cè)定內(nèi)臟脂肪含量，并行骨骼肌葡萄糖攝取試驗(yàn)評(píng)估大鼠胰島素敏感性。分離并提取胰島素抵抗大鼠骨骼肌制成肌細(xì)胞懸液，在同時(shí)設(shè)立普通小鼠IGG對(duì)照下，利用AGAROSE結(jié)合的微珠進(jìn)行免疫吸附AS160抗體，然后把細(xì)胞懸液與微珠混勻孵育，溶液中的AS160就被吸附到微珠上。去掉上清液后，再利用去污劑將吸附在微珠上的蛋白洗脫下來(lái)，應(yīng)用1433蛋白抗體和AS160的抗體結(jié)合檢測(cè)并分離這兩種蛋白，采取免疫共沉淀結(jié)合WESTERNBLOT技術(shù)研究AS160與1433蛋白之間的關(guān)系。結(jié)論在胰島素刺激下長(zhǎng)期高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌細(xì)胞中，AS160與1433蛋白存在生理性的相互作用，胰島素刺激可能增加ASL60與1433蛋白的相互作用。第三部分大鼠骨骼肌UCP3和GLUT4基因表達(dá)水平在高脂飼養(yǎng)大鼠骨骼肌胰島素抵抗發(fā)病中的作用目的探討胰島素刺激的高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗IR大鼠骨骼肌解耦聯(lián)蛋白3UCP3和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4GLUT4MRNA基因表達(dá)水平的改變，觀察高脂飼養(yǎng)IR大鼠骨骼肌內(nèi)甘油三酯TG含量改變及其意義；了解PPARΓ激動(dòng)劑羅格列酮和AMPKΑ激活劑二甲雙胍對(duì)高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的IR大鼠骨骼肌UCP3和GLUT4MRNA基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)和對(duì)IR的改善作用機(jī)制。方法雄性WISTAR大鼠分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)組大鼠均給予高脂飼料，即脂肪占總熱量比例為59％，主要為飽和脂肪酸的動(dòng)物脂肪。各組飼養(yǎng)12周，之后實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)為高脂組、羅格列酮組以劑量為3MGOKGD和二甲雙胍組300MGOKGD分別灌胃干預(yù)8周，對(duì)照組仍然給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余組仍給高脂飲食。喂養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)大鼠體重和血糖水平，空腹血漿胰島素和血脂水平，及葡萄糖耐量試驗(yàn)，測(cè)定內(nèi)臟脂肪含量，評(píng)估胰島素敏感性，測(cè)定骨骼肌葡萄糖攝取率。通過(guò)酶比色法測(cè)定各組骨骼肌TG含量，冰凍切片油紅O染色法對(duì)骨骼肌染色。應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)對(duì)照組、高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗組和應(yīng)用羅格列酮組和二甲雙胍組骨骼肌UCP3MRNA和GLUT4MRNA的表達(dá)水平。結(jié)論高脂飼養(yǎng)導(dǎo)致骨骼肌脂肪含量增加可能使骨骼肌UCP3MRNA和骨骼肌GLUT4MRNA表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致胰島素敏感性降低。羅格列酮和二甲雙胍可能部分通過(guò)減少骨骼肌TG含量，增加UCP3MRNA和GLUT4MRNA的表達(dá)減輕IR。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大鼠骨骼肌中低氧誘導(dǎo)因子-1αmRNA表達(dá)的影響.pdf精彩內(nèi)容。