簡(jiǎn)介：急性上呼吸道感染是指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的概稱，是呼吸道最常見(jiàn)的一種傳染病。本病約有70～80％由病毒引起，主要有流感病毒甲、乙、丙、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、?？刹《尽⒖滤_奇病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒等，成人以鼻病毒為主，兒童則以副流感病毒和呼吸道合胞病毒為主。本病在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中歸屬于“外感發(fā)熱”、“傷風(fēng)感冒”范疇。內(nèi)經(jīng)、傷寒論、及后世醫(yī)家，如劉完素、葉天士、吳鞠通等都本病有詳細(xì)的論述，并已形成較為完備的外感熱病理論體系。一般認(rèn)為，該病的病因?yàn)椤傲?，即“風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火”，八綱病機(jī)、臟腑病機(jī)、六經(jīng)病機(jī)、衛(wèi)氣營(yíng)血病機(jī)、三焦病機(jī)對(duì)此皆有詳實(shí)的記載。本課題通過(guò)對(duì)急性病毒性上呼吸道感染患者的中醫(yī)四診證候、發(fā)病節(jié)氣、結(jié)合血常規(guī)和血清病毒抗體檢測(cè)，探討中醫(yī)證候分型與血常規(guī)、病毒種類的相關(guān)性。目的運(yùn)用臨床流行病學(xué)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合地域、季節(jié)、年齡等多因素，探討急性病毒性上呼吸道感染的中醫(yī)證候，為特定病毒感染的中醫(yī)急性上呼吸道感染辨證論治提供客觀、相對(duì)定量的診斷標(biāo)準(zhǔn)。為中醫(yī)外感熱病的系統(tǒng)研究、中醫(yī)防治急性上呼吸道感染的流行、治療、預(yù)后提供客觀依據(jù)。方法采用前瞻性研究方法，對(duì)20069至20072前來(lái)我院急診門診和留觀的急性上呼吸道感染的病人進(jìn)行中醫(yī)四診辨證登記、病毒檢查以及隨訪。病毒檢查采用歐蒙試劑盒，免疫熒光法進(jìn)行。結(jié)果179例納入病例根據(jù)中醫(yī)四診證候，通過(guò)聚類分析，可得出聚Ⅳ類風(fēng)寒證，風(fēng)熱證、風(fēng)寒夾濕證、風(fēng)熱夾濕證型。279例納入病例當(dāng)中的64例進(jìn)行血常規(guī)檢查，分析聚類證型與白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比的關(guān)系，提示聚類Ⅳ風(fēng)熱夾濕證組與細(xì)菌感染相關(guān)；通過(guò)根據(jù)急性病毒性上呼吸道感染的癥狀學(xué)研究，針對(duì)性進(jìn)行血清流感AB，柯薩奇病毒、副流感病毒等抗體檢測(cè)。探討血清病毒抗體與聚類證型之間的關(guān)系，結(jié)果，血清流感病毒AB，柯薩奇病毒以及副流感病毒抗體在聚四類證型之間無(wú)相關(guān)性。結(jié)論1本課題收集的79例急性上呼吸道感染可聚類分為風(fēng)寒證，風(fēng)熱證、風(fēng)寒夾濕證、風(fēng)熱夾濕證。其中，風(fēng)熱夾濕證與白細(xì)胞總數(shù)、中性粒百分比升高相關(guān)。2血清流感AB，柯薩奇病毒、副流感病抗體在聚四類證型之間無(wú)相關(guān)性。

簡(jiǎn)介：乙型肝炎病毒HBV基因組全長(zhǎng)僅為3200個(gè)堿基，包括4個(gè)相互重疊的讀框前CC基因、P基因、S基因和X基因。依據(jù)核苷酸序列異質(zhì)性≥8％可將HBV毒株分成不同的基因型。到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了8個(gè)HBV基因型基因型A、B、C、D、E、F、G和H。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地帶且與基因型D有類似的基因特征，異質(zhì)性最為明顯的F型主要分布于南美及中美洲。HBV幾個(gè)主要的基因型中均發(fā)現(xiàn)基因亞型現(xiàn)象的存在。其中基因型A可分為A1A33個(gè)亞型；基因型B可分為B1B44個(gè)亞型；基因型C可分為C1C44個(gè)亞型；基因型D分為D1D44個(gè)亞型；基因型F可分為F1、F2兩個(gè)亞型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBVC1、HBVC2是中國(guó)地區(qū)最普遍的HBVC亞型，其中是HBVC1占71％393512，HBVC2占27％112512此外，在對(duì)全國(guó)血清樣本進(jìn)行基因分型的過(guò)程中，我們?nèi)我膺x取PCRRFLP分型鑒定的基因型B、C、D樣本各3份進(jìn)行了全序列的測(cè)定以判斷該分型方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以PCRRFLP分型鑒定為基因型D的部分樣本測(cè)序后比較證實(shí)為基因型C，后來(lái)的研究顯示該種毒株在S區(qū)與基因型D相同，暫時(shí)命名為HBVCD重組體。并根據(jù)其序列特征建立了該重組體的初步篩選方法。以初步篩選方法對(duì)來(lái)自甘肅的HBV血清樣本進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了7例該種重組體；選取其中部分樣本進(jìn)行HBV全基因序列的測(cè)定，測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組的存在。這種亞型均為HBV基因型C與基因D毒株的重組體。因此，在中國(guó)大陸地區(qū)至少存在3種HBVC基因亞型HBVC1、HBVC2、及HBVCD。如同基因型呈地域性分布的特點(diǎn)一樣，基因型C亞型在我國(guó)不同地區(qū)的分布也有很大差異。在北方地區(qū)，98％以上基因型C毒株均屬于C2亞型，C1亞型罕見(jiàn)；而在南方地區(qū)，55％基因型C毒株為C1亞型，C2占較小比例。HBVC1亞型與C2亞型在各省的分布情況為北京2％154與98％5354；山東1％1100與99％99100；云南13％538與87％3338；湖南19％316與81％1316；廣東63％4775與37％2875；海南79％5367與21％1467。在東南地區(qū)的福建省，C1與C2的亞型的比例分別為1％172與99％7172。在中國(guó)西部HBV慢性感染人群中，基因型C亞型的情況與其它地區(qū)不同。在甘肅地區(qū)，C亞型的分布比例C1為1％190，C2為91％8290，CD重組體為8％790。本研究中還比較了兩種主要C基因亞型C1與C2感染者之間的臨床差異。人口學(xué)資料比較發(fā)現(xiàn)，C1亞型感染者年齡較C2亞型感染者小316±124VS344±120，P003。盡管C1亞型感染者較C2亞型感染者有較高的HBEAG陽(yáng)性率，兩者之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組病例在性別比率、肝功能檢查ALT水平及總膽紅素水平及臨床診斷方面未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，HBV基因亞型存在的現(xiàn)象對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展的影響尚有待進(jìn)一步研究。在本研究的第二部分，為研究HBV基因型功能學(xué)的差異，使用了腺病毒載體將目的HBV基因?qū)胝婧思?xì)胞，對(duì)不同HBV基因型毒株的表達(dá)與復(fù)制進(jìn)行了比較研究。腺病毒ADENOVIRUS，AD分布廣泛，在許多哺乳動(dòng)物和禽類中都發(fā)現(xiàn)其存在。其中人的腺病毒有50種以上，但通常都較溫和，很少危及生命。腺病毒對(duì)于研究真核細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，RNA剪接加工，蛋白質(zhì)的合成以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化做出過(guò)重要的貢獻(xiàn)。腺病毒還具有高滴度、高穩(wěn)定性、高轉(zhuǎn)染效率、非致癌性等特點(diǎn)。此外，對(duì)野生型腺病毒進(jìn)行基因工程改造而制作的重組病毒載體系統(tǒng)，作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體、重組疫苗和基因治療載體也得到了廣泛應(yīng)用。本研究運(yùn)用了一種新的重組病毒構(gòu)建方法ADEASYTM系統(tǒng)，在體外模型中研究不同基因型HBV病毒復(fù)制活性差異。首先，我們構(gòu)建了13拷貝HBVB、HBVC全基因組，在其5’末端包含增強(qiáng)子Ⅰ及增強(qiáng)子Ⅱ，復(fù)制起點(diǎn)，X及前C啟動(dòng)子基因，前基因RNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，特異多腺苷酸化位點(diǎn)以及完整的X開(kāi)放讀框。這種結(jié)構(gòu)已被證明能在肝臟細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行有效的復(fù)制。隨后，將13拷貝HBV全基因插入到重組病毒穿梭載體PADTRACK的多克隆位點(diǎn)中，該位點(diǎn)位于CMV啟動(dòng)子及綠色熒光蛋白GFP位點(diǎn)上游，利用該系統(tǒng)，一方面可通過(guò)表達(dá)的GFP在熒光顯微鏡下觀察重組病毒感染情況，另一方面，構(gòu)建的13拷貝HBV全基因能夠利用病毒自身的調(diào)控序列啟動(dòng)HBV的復(fù)制，避免了載體上的外源啟動(dòng)子對(duì)HBV復(fù)制及表達(dá)的影響。將重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架載體PADEASY1共轉(zhuǎn)化ECOLIBJ5183細(xì)菌使之內(nèi)重組。在細(xì)菌中發(fā)生同源重組后，選出重組質(zhì)粒并酶切鑒定，將鑒定出的重組質(zhì)粒經(jīng)PACⅠ線性化后使用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)GFP可以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率和病毒的產(chǎn)生。得到重組腺病毒之后，進(jìn)行純化和擴(kuò)增，再使用兩種不同基因型HBV重組腺病毒感染HEPG2細(xì)胞。使用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG的表達(dá)情況，用美國(guó)雅培公司的化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀對(duì)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行定量分析；熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中HBV的滴度；免疫組化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBSAG及HBCAG的表達(dá)情況。結(jié)果表明，從我國(guó)慢性乙肝病毒感染者血清中獲得的HBV基因型B和C毒株，并經(jīng)過(guò)全序列的測(cè)定確定其基因型。通過(guò)酶切與連接成功構(gòu)建了兩種基因型的13拷貝HBVDNA，克隆篩選后進(jìn)行序列測(cè)定，證實(shí)了兩種基因型13拷貝HBVDNA序列正確無(wú)誤。為確保所構(gòu)建的有復(fù)制能力的13拷貝HBVDNA在病毒復(fù)制過(guò)程中不受這些重要位點(diǎn)的影響，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)核對(duì)，并與多株參考序列進(jìn)行比對(duì)，排除了有插入、缺失及重要位點(diǎn)突變的克隆。13拷貝HBVDNA序列經(jīng)雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，與腺病毒穿梭載體PADTRACK進(jìn)行連接，連接物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌，隨機(jī)挑取克隆，雙酶切法初步驗(yàn)證插入序列片段大小的正確性。重組穿梭載體再用YS1YS2進(jìn)PCR擴(kuò)增后，NDEⅠ內(nèi)切酶消化，驗(yàn)證插入序列基因型的正確性。兩種基因型的重組穿梭載體分別被命名為ADTRACKHBVB和ADTRACKHBVC；轉(zhuǎn)化感染受態(tài)細(xì)菌ADEASIER1感受態(tài)細(xì)胞得到兩種基因型的腺病毒重組體PADEASIERB和PADEASIERC，PACⅠ酶切鑒定其正確性。大量提取的重組腺病毒質(zhì)粒PADEASIERB和PADEASIERC用PACⅠ酶切線性化后，用脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞轉(zhuǎn)染710天后，即可在熒光顯微鏡下看見(jiàn)明顯的GFP熒光，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光斑點(diǎn)數(shù)也隨之增多，在普通顯微鏡下可見(jiàn)明顯的病毒蝕斑，293細(xì)胞也出現(xiàn)固縮、變圓、脫落、裂解等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象，結(jié)果證明了重組病毒的形成和擴(kuò)增。收獲轉(zhuǎn)染10天后的293細(xì)胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，再重新感染293細(xì)胞。感染2天后細(xì)胞即可看到GFP的表達(dá)，細(xì)胞也出現(xiàn)變圓、脫落、裂解等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象。收獲二次感染的細(xì)胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，取上清再次感染293細(xì)胞，進(jìn)行病毒的大量擴(kuò)增，使兩種基因型的重組腺病毒滴度約為109ML。研究表明，兩種重組病毒的包裝是成功的，并且均具有很高的滴度，能夠有效的感染293細(xì)胞，并有很強(qiáng)的GFP表達(dá)。按感染復(fù)數(shù)為5的標(biāo)準(zhǔn)，兩種基因型的腺病毒重組體分別感染HEPG2細(xì)胞。當(dāng)感染細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)收集感染細(xì)胞及上清，細(xì)胞內(nèi)HBCAG及HBSAG經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，均有蛋白表達(dá)。細(xì)胞及上清中的HBEAG和HBSAG用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可明確檢測(cè)到HBEAG及HBSAG的表達(dá)；上清及細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒經(jīng)定量檢測(cè)后有明確的上升，說(shuō)明我們所構(gòu)建的13拷貝HBVDNA能夠在HEPG2細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)和復(fù)制。分別用兩種不同HBV基因型的重組腺病毒感染HEPG2細(xì)胞，以后隔日收集感染細(xì)胞及清，并分別對(duì)上清中的病毒顆粒、HBEAG及HBSAG進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。感染第2天時(shí)，上清中即可檢測(cè)到病毒顆粒、HBEAG及HBSAG。感染第4天時(shí)上清中HBEAG及HBSAG的表達(dá)量最高，以后隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HBEAG及HBSAG的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，HBEAG及HBSAG的表達(dá)量C基因型明顯高于B基因型。上清中病毒顆粒的量在第2天時(shí)即達(dá)最高值，然后隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)，但兩種基因型間病毒定量無(wú)差別。在本研究中，我們證明了腺病毒載體能夠?qū)⒕哂袕?fù)制能力的HBV基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝細(xì)胞系，并能啟動(dòng)HBV復(fù)制導(dǎo)致完整的具有感染能力的HBV顆粒的產(chǎn)生，這說(shuō)明導(dǎo)入的HBVDNA能在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中復(fù)制。腺病毒介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染成功將為我們進(jìn)一步研究病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，比較不同的病毒株復(fù)制能力的差異，以及各病毒蛋白在病毒生活周期中的作用提供新的可靠途徑。本研究利用新型腺病毒系統(tǒng)在HBV基因型體外功能學(xué)研究方面的進(jìn)行了初步嘗試。研究結(jié)果證明，腺病毒系統(tǒng)能作為HBV體外功能學(xué)研究和毒株之間比較研究的非常有效的工具。研究的初步結(jié)果顯示，B基因型和C基因型在體外復(fù)制過(guò)程中其抗原表達(dá)有差異，基因型C明顯高于基因型B，但病毒復(fù)制水平未見(jiàn)明顯差異。由于本研究只是比較了兩種基因型之間單一毒株的差異，這種初步結(jié)果有待進(jìn)一步更深入的研究加以證實(shí)。

簡(jiǎn)介：手足口病HFOOTMOUTHDISEASEHFMD是由腸道病毒感染引起的一種嚴(yán)重的傳染病并呈現(xiàn)逐年高發(fā)態(tài)勢(shì)。近年發(fā)現(xiàn)HFMD主要病原體為腸道病毒71型ENTEROVIRUS71EV71兒童為EV71易感人群。兒童感染EV71后臨床表現(xiàn)形式多樣除典型的HFMD外還常表現(xiàn)出嚴(yán)重的中樞神經(jīng)疾病及肺水腫和或肺淤血等并發(fā)癥嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。目前對(duì)于EV71感染引發(fā)HFMD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程尚不清楚且缺乏有效的預(yù)防及治療方法常導(dǎo)致臨床醫(yī)療嚴(yán)重后果的發(fā)生因此明確HFMD病原全面分析EV71感染后病理改變探討發(fā)病機(jī)理以及研發(fā)安全、有效的HFMD疫苗成為預(yù)防和控制HFMD疾病暴發(fā)的有效手段之一。據(jù)此本論文從一例疑似HFMD的死亡案例出發(fā)從法醫(yī)病理學(xué)、分子病毒學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等幾個(gè)方面對(duì)該病例及其致病病原EV71進(jìn)行了深入的研究具體內(nèi)容有以下五個(gè)章節(jié)。第一章以文獻(xiàn)綜述的形式介紹了HFMD及EV71的研究背景主要包括HFMD的流行情況其主要病原體EV71的病毒學(xué)特點(diǎn)流行病學(xué)研究致病機(jī)理研究EV71感染的臨床診斷和治療疫苗的研究現(xiàn)狀實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇以及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理、技術(shù)路線及其作為基因工程疫苗載體的研究進(jìn)展等。最后說(shuō)明了本論文研究的內(nèi)容及意義。第二章利用常規(guī)法醫(yī)病理學(xué)分析方法對(duì)一例疑似HFMD致死案例進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)CNS病變明顯神經(jīng)細(xì)胞壞死、膠質(zhì)小結(jié)形成、炎細(xì)胞呈袖套樣浸潤(rùn)肺水腫顯著、炎癥突出確認(rèn)死因?yàn)椴《拘阅X炎及病毒性肺炎導(dǎo)致的急性呼吸、循環(huán)功能衰竭。在此基礎(chǔ)上利用RTPCR技術(shù)以國(guó)家CDC指導(dǎo)的EV71通用檢測(cè)引物證實(shí)病原體為EV71。隨后針對(duì)EV71保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增檢測(cè)了各病理組織的病毒載量利用抗EV71VP1蛋白的特異性多克隆抗體對(duì)石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了病毒抗原的組織分布。結(jié)果顯示此病例腦組織EV71病毒載量相對(duì)較高其中腦干和頸髓最高病毒抗原檢測(cè)陽(yáng)性主要集中在CNS的神經(jīng)細(xì)胞及炎細(xì)胞為病毒感染復(fù)制的主要部位肺組織雖病變明顯水腫淤血突出但病毒核酸及抗原陰性并非病毒主要感染復(fù)制部位第三章自病毒載量最高的腦干組織出發(fā)在體外RD細(xì)胞上進(jìn)行病毒的分離、傳代及空斑純化通過(guò)一步法生長(zhǎng)曲線的方法了解不同株純化病毒的感染性差異同時(shí)利用EV71VP1基因的序列對(duì)病毒株進(jìn)行基因分型。篩選出一株純化病毒擴(kuò)增出核酸序列進(jìn)行分段克隆獲得EV71病毒的全基因組并提交GENBANK。結(jié)果顯示腦干組織能成功分離到EV71XF活病毒在RD細(xì)胞上能產(chǎn)生腸道病毒特異性致細(xì)胞病變效應(yīng)CYTOPATHICEFFECTCPE透射電鏡能觀察到大小均勻、形態(tài)一致、直徑約2030NM的EV71病毒粒子。經(jīng)空斑純化后的四株病毒在體外RD細(xì)胞上感染性基本無(wú)差別VP1測(cè)序結(jié)果顯示均為C4亞型完成了一株病毒的全基因組測(cè)序基因組全長(zhǎng)為7405BPGENBANK登錄號(hào)ACCESSIONNUMBER為JQ804832基因組序列提示此次感染病毒仍為國(guó)內(nèi)流行株C4亞型全基因組序列的測(cè)定將有利于后續(xù)的深入研究。第四章對(duì)純化的EV71XF病毒進(jìn)行了建立小動(dòng)物感染模型的初步摸索。通過(guò)顱腔注射INTRACRANIALINJECTIONIC的途徑使1日齡BALBC小鼠感染EV71XF病毒觀察其表現(xiàn)隔周采血對(duì)血清特異性抗體IGG及中和抗體進(jìn)行檢測(cè)同時(shí)分離鼠腦組織中病毒再次接種1日齡小鼠獲得鼠適性毒株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1日齡BALBC小鼠能通過(guò)IC途徑感染EV71XF但無(wú)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)血清抗體IGG在感染兩周后較高但仍處于亞中和抗體水平IC二次感染可以刺激小鼠產(chǎn)生更高濃度IGG并在RD細(xì)胞上表現(xiàn)出較好的特異性及交叉性中和保護(hù)作用母?jìng)骺贵w的中和保護(hù)作用較強(qiáng)但時(shí)間短暫約4W齡時(shí)其保護(hù)作用消失反復(fù)多次鼠腦適應(yīng)可以得到感染性增強(qiáng)的鼠適株EV71XFAJQ但其毒力情況還需進(jìn)一步研究。第五章利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)開(kāi)展了EV71基因工程疫苗的初步研究。將編碼EV71XF的P1和3CD蛋白的基因分別克隆至PFASTBACDUAL載體的啟動(dòng)子PPH和PP10下游的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組PFASTBACDUALEV71XF3CDP1質(zhì)粒。重組質(zhì)粒與桿狀病毒BAC轉(zhuǎn)座后獲得重組BACBACEV71XF3CDP1。提取重組BACDNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)SF9細(xì)胞獲得重組病毒重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后表達(dá)的前體蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自組裝為病毒樣顆粒VIRUSLIKEPARTICLEVLPS經(jīng)蔗糖及氯化銫密度梯度離心進(jìn)行初步的純化WESTERNBLOT檢測(cè)目的蛋白表達(dá)與剪切透射電鏡觀察VLPS顆粒另外還構(gòu)建了新的穩(wěn)定表達(dá)3CD的細(xì)胞系SF93CD用于VLPS的構(gòu)建策略。結(jié)果顯示重組桿狀病毒ACBACEV71XF3CDP1在SF9細(xì)胞內(nèi)能同時(shí)表達(dá)前體蛋白P1和蛋白水解酶3CD3CD能正確剪切P1蛋白成為VP1等結(jié)構(gòu)蛋白并自組裝為VLPS經(jīng)蔗糖及氯化銫密度梯度離心等初步純化后WESTERNBLOT顯示VLPS具有VP1的抗原表位透射電鏡觀察VLPS的形態(tài)、大小及構(gòu)象均類似于天然的EV71病毒粒子可以作為EV71疫苗的候選物。SF93CD細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)3CD蛋白并剪切P1形成VLPS可以作為構(gòu)建VLPS的新途徑。綜合以上研究?jī)?nèi)容本研究完成了一例疑似HFMD案例的法醫(yī)病理學(xué)分析確定了其致病病原為腸道病毒EV71并從病理組織中分離、純化到一株高活性的EV71XF病毒完成了該病毒株的病毒感染活性檢測(cè)、全基因組序列測(cè)定、小鼠感染性試驗(yàn)以及基因工程疫苗等初步研究。該研究為致死性EV71病毒感染的組織病變過(guò)程的解析和機(jī)理研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也為EV71病毒的基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)對(duì)預(yù)防和控制HFMD的工作作出了重要貢獻(xiàn)。

簡(jiǎn)介：目的在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，在導(dǎo)師以往臨床及實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，觀察解毒復(fù)肝湯聯(lián)合苦參素序貫給藥對(duì)不同基因型慢性乙型肝炎的血清病毒學(xué)指標(biāo)的影響，并從基因型的分析，探討其作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的慢性乙型肝炎患者98例，按照隨機(jī)對(duì)照的原則隨機(jī)分成2組，對(duì)照組32例在苦參素序貫給藥的基礎(chǔ)上加用甘利欣、門冬氨酸鉀鎂注射液，每日1次，應(yīng)用1個(gè)月，改為隔日靜脈滴注，再應(yīng)用7次后停藥。治療組66例在以上治療的基礎(chǔ)上加用解毒復(fù)肝湯。兩組療程均為3個(gè)月。觀察兩組患者之間及治療組中基因B型、C型患者治療前后臨床癥狀、體征，血清肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL，血清病毒學(xué)標(biāo)志HBSAG、HBEAG和抗HBE及HBVDNA水平的變化，比較兩組之間及治療組中基因B型和C型患者之間的療效。結(jié)果①兩組總體療效比較治療組66例中，顯效22例，有效35例，無(wú)效7例，脫落2例，總有效率為8906％。對(duì)照組32例中，顯效6例、有效17例、無(wú)效8例，脫落1例，總有效率為7419％。治療組的總體療效與對(duì)照組比較差異有顯著性P005。③兩組臨床癥狀、體征比較治療后兩組患者的主癥、次癥及體征積分值均明顯下降，與治療前相比，差異有顯著性P005。④兩組肝功能指標(biāo)的比較與治療前比較，兩組肝功能均有明顯改善，差異有顯著性P005。⑤兩組在觀察期間均未見(jiàn)不良反應(yīng)。結(jié)論解毒復(fù)肝湯聯(lián)合苦參素序貫給藥對(duì)不同基因型慢性乙型肝炎患者具有良好療效，可明顯改善患者的臨床癥狀、體征，療效確切，其作用機(jī)制可能與解毒復(fù)肝湯恢復(fù)肝臟功能、增強(qiáng)苦參素抗HBV活性等作用有關(guān)，其中對(duì)基因B型患者的療效優(yōu)于C型患者。

簡(jiǎn)介：目的選用導(dǎo)師左俊嶺教授治療慢性乙型肝炎多年經(jīng)驗(yàn)篩選的益腎解毒方，通過(guò)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，評(píng)價(jià)在慢性乙型肝炎病毒攜帶者免疫耐受狀態(tài)下使用本方益腎解毒干預(yù)的臨床療效及病毒學(xué)效應(yīng)。目的為探求在慢性乙型肝炎病毒攜帶者免疫耐狀態(tài)下應(yīng)用中醫(yī)藥治療的有效方法。方法采用隨機(jī)對(duì)照前瞻性的研究方法，收集2014年12月至2015年2月期間于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診，并符合標(biāo)準(zhǔn)的60名慢性乙肝病毒攜帶者，隨機(jī)分為兩組，治療組30人，對(duì)照組30人。治療組給予益腎解毒方治療。對(duì)照組不給于藥物治療。以12周為一療程。觀察并對(duì)比兩組患者的癥候積分、肝功能、乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志、乙肝病毒DNA載量的變化情況。結(jié)果經(jīng)過(guò)12周的治療，治療組的中醫(yī)癥狀有效率達(dá)90％，對(duì)照組的中醫(yī)候狀有效率為66％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜005），治療組對(duì)患者癥候積分的降低顯著優(yōu)于對(duì)照組P＜001。治療組治療后各項(xiàng)癥候積分均較治療前有緩解（P＜001）對(duì)照組患者治療前后脅肋部疼痛癥候積分未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005，其余癥候均有緩解（P＜005），兩組患者的AST、ALT、GGT、TBIL、DBIL等肝功能指標(biāo)，在治療前后均未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞005）。兩組患者的血清學(xué)標(biāo)志物在治療前后未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞005）。治療組中乙肝病毒DNA載量治療前后相比，治療后明顯下降，前后分別為560±179和475±186LOG10IUML，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜001，說(shuō)明益腎解毒方具有改善患者臨床癥狀及抑制乙肝病毒復(fù)制效果。結(jié)論經(jīng)過(guò)臨床隨機(jī)對(duì)照觀察，結(jié)果顯示益腎解毒方能夠有效地改善慢性乙型肝炎病毒攜帶者在免疫耐受狀態(tài)下的部分癥狀及體征，并且具有明顯的抗病毒效果。在目前乙肝免疫耐受狀態(tài)無(wú)可靠有效干預(yù)方法的現(xiàn)狀下，本研究所證實(shí)的中醫(yī)藥益腎解毒法應(yīng)用，可為臨床提供一種較為有益的治療手段。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多HBsAg定量對(duì)peg干擾素聯(lián)合LAM治療后持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測(cè)價(jià)值.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多147例慢性乙型肝炎患者NAs治療中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的臨床分析.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的分析慢性丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUS，HCV感染者基線的肝組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)HISTOLOGICALACTIVITYINDEX，HAI、TREG、TH17細(xì)胞及IL28BRS12979860基因型的特點(diǎn)探討三者與抗HCV快速病毒學(xué)應(yīng)答RAPIDVIROLOGICALRESPONSE，RVR可能的相關(guān)性。方法收集2012年8月至2013年6月天津市第三中心醫(yī)院門診診斷的慢性丙型肝炎患者63例，記錄臨床一般情況（年齡、性別、身高、體重、可能的感染途徑、既往病史、既往治療情況）、治療前臨床及影像學(xué)資料（血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂、甲狀腺功能、抗核抗體、HCVRNA載量、HCV基因分型、IL28BRS12979860基因型、肝膽胰脾及雙腎B超）。留取63例HCV感染者及同期健康體檢者新鮮外周血標(biāo)本。按患者意愿行肝穿活檢組織檢查者33例，留取標(biāo)本。所有標(biāo)本取材均通過(guò)我院倫理委員會(huì)審核，家屬知情同意并簽字。所有患者接受標(biāo)準(zhǔn)療法STARDOFCARE，SOC抗HCV治療，定期隨訪。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)63例慢性丙型肝炎CHRONICHEPATITISC，CHC患者外周血CD3T、CD4T、CD8T、CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞頻率，并與23例健康對(duì)照HEALTHYCONTROL，HC進(jìn)行比較。通過(guò)肝穿刺組織HE染色HAEMATOXYLINEOSINSTAIN評(píng)價(jià)HAI、肝臟炎癥壞死分級(jí)GRADE，G及纖維化分期STAGE，S。免疫組織化學(xué)染色法IMMUNOHISTOCHEMISTRY，IHC標(biāo)記肝穿組織中FOXP3TREG細(xì)胞、IL17TH細(xì)胞TH17細(xì)胞。結(jié)果1CHC組外周血CD4T、CD4CD8、CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞頻率分別為2816±8295％、087±0392％、683±2209％，均高于HC組的2357±5492％、060±0120％、486±0740％P＜005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義CHC組外周血CD3T、CD8T細(xì)胞頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2基線HCVRNA載量與浸潤(rùn)肝組織的TREG細(xì)胞低度正相關(guān)R0353，P0047與HAI、外周血T細(xì)胞亞群、浸潤(rùn)肝組織的TH17細(xì)胞、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALANINETRANSAMINASE，ALT水平均無(wú)相關(guān)性。3HCV感染者基線ALT水平與浸潤(rùn)肝組織的TREG細(xì)胞呈低度負(fù)相關(guān)關(guān)系R0383，P0030與外周血T細(xì)胞亞群、浸潤(rùn)肝臟的TH17細(xì)胞及HAI均無(wú)相關(guān)性。4HAI與浸潤(rùn)肝組織的TREG細(xì)胞低度負(fù)相關(guān)R0443，P0010，與肝組織的TH17細(xì)胞低度正相關(guān)R0404，P0020，與外周血T細(xì)胞亞群無(wú)相關(guān)性。5隨著炎癥壞死分級(jí)的增加，肝組織TREG細(xì)胞數(shù)逐漸減少，肝組織TH17細(xì)胞數(shù)及HAI逐漸增加P＜005）而基線HCVRNA載量、ALT水平及外周血T細(xì)胞亞群，在各分級(jí)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞005）。6隨著纖維化分期的增加，HAI逐漸升高P＞005）。肝組織TH17細(xì)胞在S1期1918±10597HPF低于S2與S3期，而在S2與S3期無(wú)明顯差異2800±14830HPFVS2678±15903HPF。基線HCVRNA載量、血清ALT水平、外周血T細(xì)胞亞群、肝組織TREG細(xì)胞在不同肝組織纖維化分期中，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005。7基線HCVRNA、ALT、HAI、T細(xì)胞頻率，在脂肪變組與無(wú)脂肪變組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）。8IL28BRS12979860CC型與CT型相比，血清ALT水平、體重指數(shù)BODYMASSINDEX，BMI、胰島素抵抗指數(shù)HOMEOSTATICMODELASSESSMENTOFINSULINRESISTANCE，HOMAIR、外周血CD3T、CD4T、CD8T細(xì)胞頻率、CD4CD8比值、CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞頻率，HAI、炎癥壞死分級(jí)、纖維化分期、HCVRNA病毒載量、肝組織TREG細(xì)胞及TH17細(xì)胞，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞005。9基線HCVRNA載量、HOMAIR、HAI是慢性HCV感染者SOC治療達(dá)到RVR的獨(dú)立影響因素血清ALT水平、外周血T細(xì)胞亞群的頻率、肝組織TREG、TH17細(xì)胞及TREGTH17比值在RVR組與NRVR組間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論浸潤(rùn)肝組織的TREG及TH17細(xì)胞與慢性HCV感染者肝組織的炎癥有關(guān)，TH17細(xì)胞與較重的肝組織纖維化有關(guān)?；€HCVRNA載量、HOMAIR、HAI是快速病毒學(xué)應(yīng)答的獨(dú)立影響因素。IL28BRS12979860基因型與血清ALT水平、HCVRNA載量、肝組織炎癥壞死、纖維化程度及RVR均無(wú)明顯相關(guān)性。

簡(jiǎn)介：目的探討恩替卡韋治療慢性乙型肝炎（CHB）患者發(fā)生病毒學(xué)突破的相關(guān)危險(xiǎn)因素。方法收集263例CHB感染者使用恩替卡韋（ETV）治療患者的病歷資料，做回顧性調(diào)查并分析患者的生化、病毒學(xué)、用藥史、依從性等指標(biāo)是否影響病毒學(xué)突破的發(fā)生，并分析相關(guān)指標(biāo)與ETV病毒學(xué)突破的關(guān)聯(lián)。結(jié)果263例患者，經(jīng)過(guò)24個(gè)月的隨訪觀察，24例發(fā)生病毒學(xué)突破，突破發(fā)生率為913％。其中HBEAG陽(yáng)性和陰性病毒學(xué)突破率分別為1118、538，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0118）；既往有LAM使用史和無(wú)LAM使用史病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1495，513，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0007）；ETV10MG、05MG病毒學(xué)突破率分別為741，932，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1000）；有肝硬化和無(wú)肝硬化患者病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1563，704，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0038）；依從性差和依從性好的患者病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為2941，611，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0000）；ETV初治時(shí)ALT低中高三個(gè)水平組病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1024，648，1429，三個(gè)水平組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）；ETV初治時(shí)HBVDNA低中高水平組病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為506、556、1842，低中水平組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005），低、高水平組和中、高水平組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜005）。治療6個(gè)月時(shí)HBVDNA轉(zhuǎn)陰率越高，病毒學(xué)突破發(fā)生率越低。既往有拉米夫定（LAM）使用史的患者治療12個(gè)月時(shí)病毒學(xué)突破發(fā)生率為280，治療24個(gè)月時(shí)累積發(fā)生率為1495，發(fā)生病毒學(xué)突破的平均時(shí)間為（1988±476）個(gè)月；而初治時(shí)使用ETV在治療12個(gè)月時(shí)病毒學(xué)突破發(fā)生率為064，治療至24個(gè)月時(shí)發(fā)生率為513。結(jié)論既往有LAM使用史、ETV初治時(shí)HBVDNA＞107COPIESML、有肝硬化、依從性差是恩替卡韋發(fā)生病毒學(xué)突破的危險(xiǎn)因素；治療6個(gè)月時(shí)HBVDNA轉(zhuǎn)陰率越高，病毒學(xué)突破發(fā)生率越低；既往有LAM使用史的患者較ETV初治的患者病毒學(xué)突破發(fā)生率高。

簡(jiǎn)介：研究目的腸道病毒感染是導(dǎo)致兒童麻痹的重要病因除脊灰病毒外非脊灰腸道病毒中的許多血清型可引起麻痹河北省已連續(xù)11年無(wú)脊灰野病毒循環(huán)但在對(duì)急性弛緩性麻痹AFP病例的監(jiān)測(cè)中檢出許多疫苗來(lái)源的脊灰病毒及非脊灰腸道病毒NPEV該研究主要研究AFP病例的病毒學(xué)和流行病學(xué)特征為消滅脊灰工作及預(yù)防和控制由NPEV所致麻痹提供技術(shù)參考研究方法研究對(duì)象為19972002年河北省15歲以下兒童AFP病例監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中所有AFP病例對(duì)AFP病例進(jìn)行流行病學(xué)、病毒學(xué)及臨床特征的分析病例的臨床及流行病學(xué)資料來(lái)源于監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中的個(gè)案表和隨訪表按世界衛(wèi)生組織WHO脊髓灰質(zhì)炎病毒檢驗(yàn)手冊(cè)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法采用RD、L20B及HEP2三種細(xì)胞進(jìn)行病毒分離及型別鑒定脊灰病毒陽(yáng)性分離物送國(guó)家脊灰實(shí)驗(yàn)室采用PCRRFLP方法進(jìn)行型內(nèi)鑒別

簡(jiǎn)介：背景抗病毒是治療慢性乙型肝炎CHB的關(guān)鍵措施干擾素IFNΑ是主要的抗病毒治療藥物之一但I(xiàn)FNΑ治療CHB患者的療效差異較大。因此對(duì)IFNΑ療效的影響因素及預(yù)測(cè)指標(biāo)的研究尤為重要。大量研究顯示其療效受宿主因素、病毒因素及環(huán)境因素的影響宿主免疫遺傳背景的差異可能是導(dǎo)致IFNΑ治療個(gè)體化差異的重要原因之一。本研究旨在探討程序性細(xì)胞凋亡基因PD1兩個(gè)SNPS位點(diǎn)PD11、PD12與中國(guó)漢族CHB患者IFNΑ療效的相關(guān)性以期為個(gè)體化治療提供參考依據(jù)。方法采用前瞻性研究方法對(duì)135例初始抗病毒治療CHB患者的早期病毒學(xué)應(yīng)答情況進(jìn)行評(píng)估并應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCRRFLP分析技術(shù)檢測(cè)患者PD11和PD12的單核苷酸多態(tài)性SNPS分別成功鑒別出AA、AG和GG三種基因型按基因型分組分析其與IFNΑ早期病毒學(xué)應(yīng)答的相關(guān)性。結(jié)果135例CHB患者IFNΑ治療獲得早期病毒學(xué)應(yīng)答為33例244％。1、PD11位點(diǎn)①三種基因型組間的性別Χ21105P0575、年齡F0519P0596、治療前ALT水平F0187P0829、治療前HBV病毒載量F0759P0470以及IFNΑ種類Χ20058P0971均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②早期病毒學(xué)應(yīng)答率在AA、AG和GG基因型組中分別為1430、3250和1300在AA、AG和GG基因型三組間存在差異Χ26258P0044。但早期病毒學(xué)應(yīng)答在AA和GG基因型組間無(wú)顯著性差異Χ20018P0893由于AA、GG基因型組樣本含量小而AA、GG基因型組間比較P0893故采用卡方分割法將AA基因型組、GG基因型組合并與AG基因型組進(jìn)行卡方檢驗(yàn)Χ26246P0012具有顯著差異所以可以認(rèn)為AG基因型相對(duì)AA、GG基因型有較高的病毒學(xué)應(yīng)答率。2、PD12位點(diǎn)①三種基因型組間的性別Χ20518P0772、年齡F1180P0310、治療前ALT水平F1892P0155、治療前HBV病毒載量F1442P0240以及IFNΑ種類Χ20331P0848均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②早期病毒學(xué)應(yīng)答率在AA、AG和GG基因型組中分別為1820、3140和1430在AA、AG、GG基因型之間比較IFNΑ的早期病毒學(xué)應(yīng)答差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Χ23957P0138。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)PD11的SNPS可能是中國(guó)漢族CHB患者IFNΑ治療早期病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測(cè)指標(biāo)有待擴(kuò)大樣本量后再證實(shí)。

簡(jiǎn)介：一、研究目的探索中藥對(duì)SARS相關(guān)病毒學(xué)及免疫學(xué)的機(jī)理，以雞傳染性支氣管炎模型進(jìn)行SARS相關(guān)病毒學(xué)研究，以ARDS模型進(jìn)行SARS相關(guān)免疫學(xué)研究。1、探討雞傳染性支氣管炎病毒IBV的增毒傳代及幾種檢測(cè)方法，在體內(nèi)觀察加味升降散的抗病毒作用。2、體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察加味升降散的抗病毒、抑制病毒作用，以病毒蝕斑定量測(cè)定法揭示其可能的抗病毒機(jī)理。3、建立小鼠ARDS模型及探討加味升降散改善ARDS模型小鼠血?dú)獾淖饔谩?、探討加味升降散對(duì)ARDS模型小鼠氧自由基及炎性介質(zhì)的影響，并揭示其可能的抗氧化機(jī)理及細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。5、探討加味升降散對(duì)ARDS模型小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的作用，并揭示其可能的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理。二、實(shí)驗(yàn)步驟1、IBV的傳代并檢測(cè)2、加味升降散對(duì)雞傳染性支氣管炎體內(nèi)模型的影響3、IBV蝕斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)4、正常NIH小鼠動(dòng)脈血?dú)夥治觥⒎蜗禂?shù)及百草枯LD50的測(cè)定5、小鼠ARDS模型的建立、加味升降散的急性毒性實(shí)驗(yàn)及加味升降散對(duì)ARDS模型小鼠血?dú)獾挠绊?、加味升降散對(duì)MDA、SOD、NO的影響7、加味升降散對(duì)IL1Β、IL2、IL6、IL8及TNFΑ的影響8、加味升降散對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響三、實(shí)驗(yàn)方法1、按動(dòng)物病毒學(xué)的方法接種傳代IBV，NDV干擾法及侏儒胚實(shí)驗(yàn)均按動(dòng)物病毒學(xué)的方法。RTPCR檢測(cè)方法按RTPCR試劑盒說(shuō)明書操作，最終產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳產(chǎn)物進(jìn)行紫外檢測(cè)并用MINIVISIONARYTM凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果。2、IBV尿囊液，凍溶后緩慢滴入雛雞雙鼻、雙眼，然后隨機(jī)分為正常組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，中藥大、中、小劑量，攻毒后10小時(shí)予以藥物治療，中藥大劑量組21、中劑量組11、小劑量組12濃縮，每只小鼠每天灌胃06ML，分兩次灌胃。陽(yáng)性藥物組予更昔絡(luò)韋10MGKG，用蒸餾水配制后灌胃06ML只，正常組及模型組灌等體積蒸餾水。共觀察9天，期間主要觀察雛雞的癥狀、大小便、死亡等指標(biāo)。I3、雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行，培養(yǎng)一天后顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁，滿視野見(jiàn)到致密的細(xì)胞單層即可以用于實(shí)驗(yàn)。雛雞肺和氣管等組織研缽好后倒入生理鹽水，并離心取上清，每管加雙抗終濃度為1萬(wàn)單位ML后稀釋為101～1099個(gè)稀釋度。將稀釋好的病毒接種于成纖維細(xì)胞上，放37℃、5％CO2的孵育箱中感作45～60分鐘。最后倒入配好的瓊脂糖，待凝固后將培養(yǎng)板倒過(guò)來(lái)，放在孵育箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)。到時(shí)間觀察蝕斑形成情況并計(jì)蝕斑數(shù)。4、左手提取固定小鼠，右手持肝素鈉濕潤(rùn)的注射器盲穿小鼠心臟，抽動(dòng)脈血500UL左右，針頭迅速刺入橡皮塞，迅速送血?dú)夥治鰞x分析，小鼠尸體開(kāi)胸取肺，電子天平稱重，濕肺重除以體重乘以100得肺系數(shù)。百草枯LD50的測(cè)定按汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院謝仰民教授等的方法，將實(shí)驗(yàn)小鼠分為4864MGKG、6144MGKG、768MGKG、96MGKG、120MGKG、150MGKG5個(gè)劑量組，一次性灌胃處理。共觀察14天，每日計(jì)死亡小鼠數(shù)，24小時(shí)內(nèi)死亡不計(jì)入統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以寇氏法計(jì)算。5、1ARDS模型的建立將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，即正常組、攻毒后1天、2天、3天、4天組，每組小鼠一次性灌百草枯018ML造模。攻毒后每天采血檢測(cè)血?dú)?。各組血?dú)饨Y(jié)果進(jìn)行比較分析。2加味升降散的急性毒性實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白對(duì)照組，中藥大、中、小劑量組，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12H后一次性灌不同濃縮度中藥03ML，空白對(duì)照組灌等體積蒸餾水。每天上、下午各觀察一次，連續(xù)觀察1周，觀察記錄受試小鼠活動(dòng)、行為及死亡等情況，死亡小鼠及時(shí)進(jìn)行尸檢。3加味升降散對(duì)血?dú)獾挠绊憣?shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組、模型組、中藥大、中、小劑量組，除正常對(duì)照組外一次性灌百草枯018ML造模，10小時(shí)后給藥治療，3天后抽動(dòng)脈血測(cè)血?dú)?。?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取肺臟用10％福爾馬林固定，進(jìn)行切片、HE染色，結(jié)果用光鏡觀察并拍照。6、將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、中藥大、中、小劑量組，造模及治療方法同前。SOD、MDA、NO測(cè)定均按其試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，最后按公式計(jì)算。7、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模、用藥方法同前。IL1Β、IL2、IL6、IL8及TNFΑ檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，最后按公式計(jì)算。8、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模、用藥方法同前。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)摘除小鼠眼球取靜脈全血約05ML左右抗凝，取30UL全血于上樣管中，按T淋巴細(xì)胞亞群試劑盒說(shuō)明書加CD3、CD4、CD83種熒光抗體，避光孵育15～30分鐘，加1ML已配制好的1溶血素，震蕩混勻后孵育10～15分鐘，澄清之后1000RPM離心5分鐘，去上清，加500ΜLPBS重懸，混勻后上機(jī)檢測(cè)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、盲傳3代IBV，經(jīng)NDV干擾法測(cè)定其滴度IBV的毒力在105～106之間。NDV的效價(jià)為11024。侏儒胚實(shí)驗(yàn)其EID50為02毫升10566，這與NDV干擾試驗(yàn)結(jié)果相符。RTPCR法檢測(cè)IBV病毒，證實(shí)病毒RNA擴(kuò)增的大小約為1404BP，與預(yù)期值一致，說(shuō)明擴(kuò)增出的病毒為IBV病毒。2、攻毒第1天未見(jiàn)明顯異常，第2天出現(xiàn)輕微的癥狀，如精神不振，呆立等，第3天開(kāi)始癥狀明顯，出現(xiàn)精神不振、咳嗽、甩鼻、抓鼻、引頸樣呼吸、打噴嚏、呆立、羽毛松亂、進(jìn)食減少、少數(shù)有氣管羅音，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸困難。攻毒3～7天癥狀明顯，第8天開(kāi)始癥狀減輕，雛雞開(kāi)始活躍。攻毒第3天下午開(kāi)始雛雞死亡，3～5天為死亡高峰期，第6天開(kāi)始死亡減少，第8天始幾乎無(wú)死亡。3、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)所用的方法是半胚法，細(xì)胞貼壁好、生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)時(shí)間短，可以提高效率。培養(yǎng)時(shí)間一般為24～48小時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)1天后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)良好。病毒接種于成纖維細(xì)胞后成功形成了蝕斑，我們把病毒稀釋了9個(gè)濃度，101～109，101～106稀釋度，模型組和藥物組比較差異顯著，用藥組蝕斑明顯減少。當(dāng)稀釋到107時(shí)藥物組蝕斑很少，故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。4、正常NIH小鼠動(dòng)脈血PAO2KPA范圍為1077～14831207±127PACO2KPA范圍為305～626458±102；肺系數(shù)范圍％為041～076058±0099PQ經(jīng)口染毒LD50為87096MGKG。5、攻毒后第2天開(kāi)始PAO2、PAO2FIO2等指標(biāo)均明顯下降，PACO2均顯著增高，與正常組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜001。6、SOD造模后指標(biāo)明顯下降，和正常組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)，P＜001，用藥后指標(biāo)呈不同程度升高，和模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯；MDA造模后指標(biāo)明顯升高，模型組與正常組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，治療后指標(biāo)明顯下降，各中藥組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著，P＜001；NO模型組指標(biāo)和正常組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜001，用藥后指標(biāo)不同程度下降，和模型組比較，有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜001。7、IL1Β模型組指標(biāo)顯著高于正常組，P＜001，大劑量組和中劑量組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL2模型組指標(biāo)顯著低于正常組，P＜001，大劑量組、中劑量組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大、中劑量組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜001，小劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；IL6模型組和各中藥組與正常組相比，指標(biāo)均升高，P＜001，大、中、小劑量組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜001；IL8造模后指標(biāo)明顯上升，和正常對(duì)照組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)治療后指標(biāo)不同程度下降，和模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，說(shuō)明治療后指標(biāo)明顯下降；TNFΑ模型組的指標(biāo)比正常組明顯升高，P＜001，各中藥組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P均＜001，大、中、小劑量比較，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞005。8、CD3、CD4、CD8各指標(biāo)造模后明顯下降，與正常對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均顯著，P＜001或P＜005。五、結(jié)論1、我們通過(guò)NDV干擾法、侏儒胚實(shí)驗(yàn)、RTPCR法檢測(cè)盲傳3代的IBV病毒，明確了所傳病毒確為IBV病毒，其EID50為10566。2、加味升降散能抑制病毒，提高雛雞抵抗力，增強(qiáng)抗病毒能力，能較好地改善癥狀，減少死亡率，中藥有一定死亡保護(hù)作用。3、加味升降散能減少病毒蝕斑的形成，有較好的抑制病毒、抗病毒能力。4、受試藥物在設(shè)計(jì)的劑量范圍內(nèi)是安全的，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)毒性；加味升降散能明顯改善模型小鼠血?dú)猓猩逷AO2降低PACO2作用，并能減輕ARDS模型小鼠癥狀，改善模型小鼠病理?yè)p害。5、加味升降散有抗氧化作用，從而改善病理?yè)p害。6、加味升降散能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，抑制巨噬細(xì)胞體外分泌IL1、TNFΑ，并能抑制IL6、IL8的分泌，減少炎癥介質(zhì)等對(duì)機(jī)體的損害，減輕肺水腫，并促進(jìn)IL2的分泌。本方有免疫調(diào)節(jié)作用。7、加味升降散可以糾正T細(xì)胞亞群紊亂狀態(tài)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IL2，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。

簡(jiǎn)介：背景對(duì)慢性乙型肝炎的自然史研究表明，慢性HBV感染者病情進(jìn)展和預(yù)后與HBV復(fù)制密切相關(guān)。高病毒血癥、HBEAG持續(xù)陽(yáng)性、ALT水平高或反復(fù)波動(dòng)是發(fā)生肝硬化的主要高危因素。自發(fā)性或經(jīng)抗病毒治療后HBEAG血清轉(zhuǎn)換，且HBVDNA持續(xù)轉(zhuǎn)陰和ALT持續(xù)正常者的生存率較高。在同樣的遺傳背景下，HBV病毒負(fù)荷是肝硬化患者發(fā)生HCC的最重要的高危因素。說(shuō)明HBV活動(dòng)復(fù)制是影響慢性HBV感染者轉(zhuǎn)歸的最重要因素，抗病毒治療是慢性乙型肝炎治療的關(guān)鍵所在。Α干擾素類和核苷類似物是目前被公認(rèn)為有效的抗乙肝病毒藥物。和Α干擾素相比，核苷類似物其毒副作用少，耐受性好，使用方便，能應(yīng)用于不能使用干擾素的慢性HBV感染患者，是目前慢性乙型肝炎抗病毒治療研究的熱點(diǎn)。其中，阿德福韋酯與其他幾種核苷類似物比較，一方面具有耐藥率低的特點(diǎn)，治療1年未檢出阿德福韋酯耐藥株；另一方面，與拉米夫定、恩替卡韋及特比夫定無(wú)交叉耐藥。因此，阿德福韋酯在核苷類似物中有著特殊的地位，已代替拉米夫定成為一線抗乙肝病毒藥物之一。阿德福韋酯可明顯抑制HBVDNA復(fù)制，但其抑制作用在不同個(gè)體中差異較大，僅部分病例獲得完全應(yīng)答。影響阿德福韋酯抗乙肝病毒療效的因素不十分清楚。血清HBVDNA、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、HBEAG血清轉(zhuǎn)換是常用于抗乙肝病毒藥物療效評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。從理論上講，抗病毒療效主要受到藥物、HBV和人體免疫狀態(tài)三方面的影響，如用藥療程、HBV基因型、治療前HBVDNA含量及病毒變異及ALT水平等。目的本研究的主要目的在于評(píng)價(jià)阿德福韋酯對(duì)中國(guó)慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA的抑制效果，同時(shí)，研究HBV基因型、治療前HBVDNA載量、ALT水平、HBEAG狀態(tài)等與阿德福韋酯病毒學(xué)應(yīng)答的關(guān)系，為制訂個(gè)體化抗病毒治療方案提供重要參考信息。方法符合慢性乙型肝炎診斷及方案入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)病例56例，血清HBVDNA定量≥10拷貝／ML、血清ALT水平15且拷貝／ML，0274±114LOG拷貝／MLP拷貝／ML，ALT復(fù)常率達(dá)714％40／56，HBEAG血清轉(zhuǎn)換率196％9／46。286％16／56獲得完全應(yīng)答，其中HBEAG陽(yáng)性／抗HBE陰性者7例，HBEAG陰性／抗HBE陽(yáng)性者9例。說(shuō)明阿德福韋酯能通過(guò)抑制HBV復(fù)制改善肝功能，促進(jìn)HBEAG血清轉(zhuǎn)換。HBV基因型分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，52例患者中B型和C型分別占538％和462％，未發(fā)現(xiàn)其他基因型，說(shuō)明B型和C型是本地區(qū)HBV感染的主要基因型。比較兩種基因型感染者的基線HBVDNA載量、ALT水平、HBEAG狀態(tài)等無(wú)明顯差異性分布，說(shuō)明慢性HBV感染者的HBVDNA載量、ALT水平及HBEAG狀態(tài)與感染HBV基因型B型或C型無(wú)顯著相關(guān)。HBV基因型與阿德福韋酯療效的關(guān)系目前并不十分清楚。比較B型和C型感染者治療40周的療效發(fā)現(xiàn)，兩組HBVDNA載量的變化、ALT復(fù)常率及HBEAG血清轉(zhuǎn)換率無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明感染HBV基因型B型或C型對(duì)阿德福韋酯的療效相當(dāng)，療效不受基因型影響?；€HBVDNA拷貝／ML組及基線HBVDNA≥110拷貝／ML組的HBVDNA陰轉(zhuǎn)率分別為842％、405％P拷貝／ML和732±103LOG10拷貝／MLP拷貝／ML者，使用阿德福韋酯治療后的HBVDNA陰轉(zhuǎn)率、HBEAG血清轉(zhuǎn)換率及完全應(yīng)答率均較高?；€ALT水平≥5ULN者，使用阿德福韋酯治療后HBVDNA載量下降幅度、HBVDNA陰轉(zhuǎn)率明顯高于ALT水平較低者，說(shuō)明基線ALT水平也是影響阿德福韋酯療效的因素之一，基線ALT水平越高，療效越好。但本研究未顯示ALT水平對(duì)完全應(yīng)答有明顯影響?；€HBEAG陰性組和HBEAG陽(yáng)性組NHBVDNAN轉(zhuǎn)率分別為923％12／13和442％19／43P拷貝／ML和737±090LOG拷貝／ML，P拷貝／ML，ALT≥5倍正常值上限是取得療效的有利因素。感染HBV基因型B型或C型、HBEAG狀態(tài)、年齡、性別、HBV感染家族史等因素與阿德福韋酯的病毒學(xué)應(yīng)答無(wú)關(guān)。

簡(jiǎn)介：目的分析乙肝病毒HEPATITISBVIRUS，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)RTI233V變異的演變規(guī)律及其與阿德福韋酯ADV耐藥的相關(guān)性。方法分析了9830例慢性HBV感染者血清樣本中HBVRTI233V變異的檢出率。選擇其中2例代表性患者的動(dòng)態(tài)收集血清樣本，擴(kuò)增HBVRT基因并克隆測(cè)序（＞20個(gè)克隆樣本）以觀察RTI233V變異的演變過(guò)程。構(gòu)建PTRIEXHBV11倍野生株WT、3種臨床變異株RTI233V、RTN236T、RTI233VRTN236T和定點(diǎn)回復(fù)突變株RTN236T復(fù)制子，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEPG2肝癌細(xì)胞，分別加入不同濃度梯度或最高濃度的拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV和替諾福韋TDF作用，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同藥物濃度作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA水平，分析變異病毒復(fù)制力與表型耐藥變化特點(diǎn)。結(jié)果9830例慢乙肝患者血清樣本中共檢出RTI233V位點(diǎn)變異28例，檢出率為028％，其中RTI233V單獨(dú)變異19例，與RTN236T等經(jīng)典耐藥變異聯(lián)合出現(xiàn)9例。該變異的檢出患者均有ADV治療史，其中16例571％接受ADV單藥治療6個(gè)月以上，12例429％接受包括ADV的多藥序貫聯(lián)合治療1年以上。患者1相對(duì)病毒復(fù)制力與表型耐藥分析顯示，RTI233V變異株的復(fù)制力與野生株接近982％，RTN236T變異株則較野生株顯著降低554％RTI233VRTN236T變異株的相對(duì)病毒復(fù)制力為野生株的1004％，表明RTI233V變異可明顯恢復(fù)RTN236T變異株受損的復(fù)制力RTN236T、RTI233VRTN236T和RTI233V變異株對(duì)ADV的敏感性分別為野生株的1682，1528和1157，RTN236T和RTI233VRTN236T變異株對(duì)ADV耐藥，而RTI233V變異株對(duì)ADV仍然敏感，與RTN236T聯(lián)合變異對(duì)ADV耐藥性的影響不大?；颊?RTI233V變異株的相對(duì)病毒復(fù)制力為野生株的1025％對(duì)ADV的敏感性為野生株的1076。RTI233V變異株對(duì)ADV及LAM、ETV和TDF均敏感。ADV對(duì)臨床變異株RTI233VRTN236T和定點(diǎn)回復(fù)突變株RTN236TLAB的抑制率相似，進(jìn)一步證實(shí)RTI233V變異株對(duì)ADV耐藥性影響不大。結(jié)論RTI233V位點(diǎn)變異與ADV應(yīng)答不佳相關(guān)，但不直接降低病毒對(duì)ADV的敏感程度，可以恢復(fù)經(jīng)典ADV耐藥病毒株的復(fù)制力，是一種復(fù)制力補(bǔ)償變異。

簡(jiǎn)介：研究背景乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV感染呈世界件流行全球約20億人曾感染過(guò)HBV其中35億人為慢性HBV感染者每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌HCC。我國(guó)HBV感染率較高159歲人群的HBSAG陽(yáng)性率為718％慢性HBV感染嚴(yán)重危害著我國(guó)人民的健康。抗HBV治療是慢性乙型病毒性肝炎CHRONICHEPATITISBCHB治療的關(guān)鍵拉米夫定LAMIVUDINELAM是最常用的抗HBV藥物之一它能有效抑制HBV復(fù)制減少肝臟的炎癥活動(dòng)延緩或阻止肝臟疾病的進(jìn)展減少肝癌的發(fā)生率。然而長(zhǎng)期的LAM治療會(huì)篩選出YMDD變異株RTM204VIS從而產(chǎn)生了LAM的耐藥。阿德福韋酯ADEFOVIRDIPVOXILADV是阿德福韋的前體口服藥物除了可以有效地抑制HBV野生毒株復(fù)制體內(nèi)和體外研究都證實(shí)阿德福韋可以有效地抑制YMDD變異株的復(fù)制因而被廣泛應(yīng)用于LAM耐藥患者的救援治療。聚乙二醇干擾素Α2Α派羅欣PEGASYS是一種長(zhǎng)效干擾素它的半衰期長(zhǎng)一周一次的給藥可以提高治療末應(yīng)答和持久應(yīng)答率優(yōu)于傳統(tǒng)干擾素是LAM耐藥患者救援治療的一個(gè)可能選擇。研究表明使用ADV單藥治療后LAM耐藥患者體內(nèi)的YMDD變異株會(huì)逐漸消失野生株逐漸取代YMDD變異株成為HBV準(zhǔn)種中的優(yōu)勢(shì)株。使用派羅欣治療后LAM耐藥患者體內(nèi)的YMDD變異株將如何變化目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。研究目的1、探討派羅欣治療后YMDD變異株的動(dòng)態(tài)變化比較派羅欣及ADV作用下YMDD變異株動(dòng)態(tài)變化之間的差異。2、探索停止LAM治療后YMDD變異株的演化情況及YMDD變異株的演化與抗HBV療效之間的關(guān)系。3、比較ADV單藥和聯(lián)合LAM治療LAM耐藥患者的臨床療效為選擇合適的抗HBV方案對(duì)LAM耐藥患者進(jìn)行救援治療提供線索。研究方法1停止LAM治療后YMDD變異的逆轉(zhuǎn)11樣本來(lái)源所有患者均來(lái)自2005年到2008年間我科參加的ML18376臨床試驗(yàn)LAM耐藥HBEAG陽(yáng)性CHB患者以21的比例隨機(jī)分配到APEG組、BADV組兩組我科兩組入組患者分別為25例、15例。A組患者給予PEGASYS180ΜG1周治療48周停藥后隨防24周；B組患者給予ADV10MGD治療72周；所有患者在頭12周內(nèi)均聯(lián)合使用LAM100MGD治療。12HBVDNA抽提收集患者12周、16周、24周、48周、72周等時(shí)間點(diǎn)的系列血清用DNA抽提試劑盒QIAAMPDNABLOODMINIKIT從血清每個(gè)血清樣本使用量為200ΜL中提取HBVDNA。13HBVRT區(qū)的PCR擴(kuò)增使用巢式PCR擴(kuò)增HBVRT區(qū)第二輪PCR產(chǎn)物直接送上海英駿公司測(cè)序。14測(cè)序結(jié)果分析測(cè)序結(jié)果與GENBANK報(bào)道的AG基因型別的HBV序列進(jìn)行同源件比對(duì)用HBVS區(qū)做進(jìn)化樹(shù)來(lái)進(jìn)行基因分型。序列比對(duì)用MEGA4軟件進(jìn)行測(cè)序峰圖用CHROMAS軟件分析。15統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均使用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析率的比較用X2檢驗(yàn)分析。所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗(yàn)P2停止LAM治療后YMDD變異株的克隆演化21樣本來(lái)源所有4位患者均來(lái)自ML18376臨床試驗(yàn)。22HBVDNA抽提、HBVRT區(qū)的擴(kuò)增同前擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收回收產(chǎn)物一部分送上海英駿公司測(cè)序一部分用于下一步實(shí)驗(yàn)。23HBVRT區(qū)的克隆分析將PCR純化產(chǎn)物與PMDTM19TVECT連接后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有AMPICILLIN、IPTG、XGAL的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。每個(gè)血清樣品隨機(jī)挑選30個(gè)白色克降在LB培養(yǎng)基中37℃225RPM振蕩培養(yǎng)6至8小時(shí)。經(jīng)PCR鑒定后將所有陽(yáng)性菌液送上海英駿公司測(cè)序最終有來(lái)自18個(gè)血清樣本的370個(gè)克隆成功測(cè)序。3、阿德福韋酯單藥和聯(lián)合LAM治療LAM耐藥HBEAG陽(yáng)性慢性乙型肝炎的療效比較對(duì)24例ADV單藥及28例ADV聯(lián)合LAM治療的LAM耐藥HBEAG陽(yáng)性慢性乙型肝炎進(jìn)行回顧性分析比較兩組患者在HBVDNA、ALT水平及HBVDNA檢測(cè)不到率、ALT復(fù)常率上的差異。結(jié)論1、停止LAM治療后野生株在HBV準(zhǔn)種中的比例會(huì)逐漸增加并最終取代YMDD變異株成為HBV準(zhǔn)種中的優(yōu)勢(shì)株。2、大多數(shù)患者體內(nèi)的YMDD變異株在停止LAM治療4周后發(fā)生逆轉(zhuǎn)RTL80VI、RTL180M等補(bǔ)償變異能減慢YMDD變異逆轉(zhuǎn)的發(fā)生。3、RTL80VI、RTL180M、RTM204VI三者通常連鎖發(fā)生于同一HBV毒株上且會(huì)在停止LAM治療后同步逆轉(zhuǎn)。4、ADV單藥或聯(lián)合LAM均是治療LAM耐藥HBEAG陽(yáng)性CHB的有效方法總體來(lái)說(shuō)聯(lián)合治療的療效要優(yōu)于單藥治療。5、即使出現(xiàn)了LAM耐藥在后續(xù)的治療中依然有必要聯(lián)合使用LAM來(lái)抗HBV治療值得進(jìn)一步探討PEGASYS聯(lián)合LAM治療LAM耐藥患者的療效和安全性。