簡介：急性上呼吸道感染是指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的概稱，是呼吸道最常見的一種傳染病。本病約有70～80％由病毒引起，主要有流感病毒甲、乙、丙、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、?？刹《尽⒖滤_奇病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒等，成人以鼻病毒為主，兒童則以副流感病毒和呼吸道合胞病毒為主。本病在祖國醫(yī)學(xué)中歸屬于“外感發(fā)熱”、“傷風(fēng)感冒”范疇。內(nèi)經(jīng)、傷寒論、及后世醫(yī)家，如劉完素、葉天士、吳鞠通等都本病有詳細的論述，并已形成較為完備的外感熱病理論體系。一般認為，該病的病因為“六淫”，即“風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火”，八綱病機、臟腑病機、六經(jīng)病機、衛(wèi)氣營血病機、三焦病機對此皆有詳實的記載。本課題通過對急性病毒性上呼吸道感染患者的中醫(yī)四診證候、發(fā)病節(jié)氣、結(jié)合血常規(guī)和血清病毒抗體檢測，探討中醫(yī)證候分型與血常規(guī)、病毒種類的相關(guān)性。目的運用臨床流行病學(xué)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法及實驗室檢測技術(shù)，結(jié)合地域、季節(jié)、年齡等多因素，探討急性病毒性上呼吸道感染的中醫(yī)證候，為特定病毒感染的中醫(yī)急性上呼吸道感染辨證論治提供客觀、相對定量的診斷標(biāo)準(zhǔn)。為中醫(yī)外感熱病的系統(tǒng)研究、中醫(yī)防治急性上呼吸道感染的流行、治療、預(yù)后提供客觀依據(jù)。方法采用前瞻性研究方法，對20069至20072前來我院急診門診和留觀的急性上呼吸道感染的病人進行中醫(yī)四診辨證登記、病毒檢查以及隨訪。病毒檢查采用歐蒙試劑盒，免疫熒光法進行。結(jié)果179例納入病例根據(jù)中醫(yī)四診證候，通過聚類分析，可得出聚Ⅳ類風(fēng)寒證，風(fēng)熱證、風(fēng)寒夾濕證、風(fēng)熱夾濕證型。279例納入病例當(dāng)中的64例進行血常規(guī)檢查，分析聚類證型與白細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比的關(guān)系，提示聚類Ⅳ風(fēng)熱夾濕證組與細菌感染相關(guān)；通過根據(jù)急性病毒性上呼吸道感染的癥狀學(xué)研究，針對性進行血清流感AB，柯薩奇病毒、副流感病毒等抗體檢測。探討血清病毒抗體與聚類證型之間的關(guān)系，結(jié)果，血清流感病毒AB，柯薩奇病毒以及副流感病毒抗體在聚四類證型之間無相關(guān)性。結(jié)論1本課題收集的79例急性上呼吸道感染可聚類分為風(fēng)寒證，風(fēng)熱證、風(fēng)寒夾濕證、風(fēng)熱夾濕證。其中，風(fēng)熱夾濕證與白細胞總數(shù)、中性粒百分比升高相關(guān)。2血清流感AB，柯薩奇病毒、副流感病抗體在聚四類證型之間無相關(guān)性。

簡介：乙型肝炎病毒HBV基因組全長僅為3200個堿基，包括4個相互重疊的讀框前CC基因、P基因、S基因和X基因。依據(jù)核苷酸序列異質(zhì)性≥8％可將HBV毒株分成不同的基因型。到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了8個HBV基因型基因型A、B、C、D、E、F、G和H。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地帶且與基因型D有類似的基因特征，異質(zhì)性最為明顯的F型主要分布于南美及中美洲。HBV幾個主要的基因型中均發(fā)現(xiàn)基因亞型現(xiàn)象的存在。其中基因型A可分為A1A33個亞型；基因型B可分為B1B44個亞型；基因型C可分為C1C44個亞型；基因型D分為D1D44個亞型；基因型F可分為F1、F2兩個亞型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBVC1、HBVC2是中國地區(qū)最普遍的HBVC亞型，其中是HBVC1占71％393512，HBVC2占27％112512此外，在對全國血清樣本進行基因分型的過程中，我們?nèi)我膺x取PCRRFLP分型鑒定的基因型B、C、D樣本各3份進行了全序列的測定以判斷該分型方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以PCRRFLP分型鑒定為基因型D的部分樣本測序后比較證實為基因型C，后來的研究顯示該種毒株在S區(qū)與基因型D相同，暫時命名為HBVCD重組體。并根據(jù)其序列特征建立了該重組體的初步篩選方法。以初步篩選方法對來自甘肅的HBV血清樣本進行了分析，發(fā)現(xiàn)了7例該種重組體；選取其中部分樣本進行HBV全基因序列的測定，測序結(jié)果證實重組的存在。這種亞型均為HBV基因型C與基因D毒株的重組體。因此，在中國大陸地區(qū)至少存在3種HBVC基因亞型HBVC1、HBVC2、及HBVCD。如同基因型呈地域性分布的特點一樣，基因型C亞型在我國不同地區(qū)的分布也有很大差異。在北方地區(qū)，98％以上基因型C毒株均屬于C2亞型，C1亞型罕見；而在南方地區(qū)，55％基因型C毒株為C1亞型，C2占較小比例。HBVC1亞型與C2亞型在各省的分布情況為北京2％154與98％5354；山東1％1100與99％99100；云南13％538與87％3338；湖南19％316與81％1316；廣東63％4775與37％2875；海南79％5367與21％1467。在東南地區(qū)的福建省，C1與C2的亞型的比例分別為1％172與99％7172。在中國西部HBV慢性感染人群中，基因型C亞型的情況與其它地區(qū)不同。在甘肅地區(qū)，C亞型的分布比例C1為1％190，C2為91％8290，CD重組體為8％790。本研究中還比較了兩種主要C基因亞型C1與C2感染者之間的臨床差異。人口學(xué)資料比較發(fā)現(xiàn)，C1亞型感染者年齡較C2亞型感染者小316±124VS344±120，P003。盡管C1亞型感染者較C2亞型感染者有較高的HBEAG陽性率，兩者之間并無統(tǒng)計學(xué)差異。兩組病例在性別比率、肝功能檢查ALT水平及總膽紅素水平及臨床診斷方面未見統(tǒng)計學(xué)差異。因此，HBV基因亞型存在的現(xiàn)象對于疾病發(fā)生發(fā)展的影響尚有待進一步研究。在本研究的第二部分，為研究HBV基因型功能學(xué)的差異，使用了腺病毒載體將目的HBV基因?qū)胝婧思毎瑢Σ煌琀BV基因型毒株的表達與復(fù)制進行了比較研究。腺病毒ADENOVIRUS，AD分布廣泛，在許多哺乳動物和禽類中都發(fā)現(xiàn)其存在。其中人的腺病毒有50種以上，但通常都較溫和，很少危及生命。腺病毒對于研究真核細胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，RNA剪接加工，蛋白質(zhì)的合成以及細胞轉(zhuǎn)化做出過重要的貢獻。腺病毒還具有高滴度、高穩(wěn)定性、高轉(zhuǎn)染效率、非致癌性等特點。此外，對野生型腺病毒進行基因工程改造而制作的重組病毒載體系統(tǒng)，作為哺乳動物細胞表達載體、重組疫苗和基因治療載體也得到了廣泛應(yīng)用。本研究運用了一種新的重組病毒構(gòu)建方法ADEASYTM系統(tǒng)，在體外模型中研究不同基因型HBV病毒復(fù)制活性差異。首先，我們構(gòu)建了13拷貝HBVB、HBVC全基因組，在其5’末端包含增強子Ⅰ及增強子Ⅱ，復(fù)制起點，X及前C啟動子基因，前基因RNA轉(zhuǎn)錄起始位點，特異多腺苷酸化位點以及完整的X開放讀框。這種結(jié)構(gòu)已被證明能在肝臟細胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中進行有效的復(fù)制。隨后，將13拷貝HBV全基因插入到重組病毒穿梭載體PADTRACK的多克隆位點中，該位點位于CMV啟動子及綠色熒光蛋白GFP位點上游，利用該系統(tǒng)，一方面可通過表達的GFP在熒光顯微鏡下觀察重組病毒感染情況，另一方面，構(gòu)建的13拷貝HBV全基因能夠利用病毒自身的調(diào)控序列啟動HBV的復(fù)制，避免了載體上的外源啟動子對HBV復(fù)制及表達的影響。將重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架載體PADEASY1共轉(zhuǎn)化ECOLIBJ5183細菌使之內(nèi)重組。在細菌中發(fā)生同源重組后，選出重組質(zhì)粒并酶切鑒定，將鑒定出的重組質(zhì)粒經(jīng)PACⅠ線性化后使用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細胞，通過GFP可以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率和病毒的產(chǎn)生。得到重組腺病毒之后，進行純化和擴增，再使用兩種不同基因型HBV重組腺病毒感染HEPG2細胞。使用ELISA法檢測細胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG的表達情況，用美國雅培公司的化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀對細胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG進行檢測并進行定量分析；熒光定量法檢測細胞及培養(yǎng)上清中HBV的滴度；免疫組化檢測細胞內(nèi)HBSAG及HBCAG的表達情況。結(jié)果表明，從我國慢性乙肝病毒感染者血清中獲得的HBV基因型B和C毒株，并經(jīng)過全序列的測定確定其基因型。通過酶切與連接成功構(gòu)建了兩種基因型的13拷貝HBVDNA，克隆篩選后進行序列測定，證實了兩種基因型13拷貝HBVDNA序列正確無誤。為確保所構(gòu)建的有復(fù)制能力的13拷貝HBVDNA在病毒復(fù)制過程中不受這些重要位點的影響，對測序結(jié)果進行仔細核對，并與多株參考序列進行比對，排除了有插入、缺失及重要位點突變的克隆。13拷貝HBVDNA序列經(jīng)雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，與腺病毒穿梭載體PADTRACK進行連接，連接物轉(zhuǎn)化JM109細菌，隨機挑取克隆，雙酶切法初步驗證插入序列片段大小的正確性。重組穿梭載體再用YS1YS2進PCR擴增后，NDEⅠ內(nèi)切酶消化，驗證插入序列基因型的正確性。兩種基因型的重組穿梭載體分別被命名為ADTRACKHBVB和ADTRACKHBVC；轉(zhuǎn)化感染受態(tài)細菌ADEASIER1感受態(tài)細胞得到兩種基因型的腺病毒重組體PADEASIERB和PADEASIERC，PACⅠ酶切鑒定其正確性。大量提取的重組腺病毒質(zhì)粒PADEASIERB和PADEASIERC用PACⅠ酶切線性化后，用脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染293細胞轉(zhuǎn)染710天后，即可在熒光顯微鏡下看見明顯的GFP熒光，隨著培養(yǎng)時間的延長，熒光斑點數(shù)也隨之增多，在普通顯微鏡下可見明顯的病毒蝕斑，293細胞也出現(xiàn)固縮、變圓、脫落、裂解等明顯的細胞病變現(xiàn)象，結(jié)果證明了重組病毒的形成和擴增。收獲轉(zhuǎn)染10天后的293細胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，再重新感染293細胞。感染2天后細胞即可看到GFP的表達，細胞也出現(xiàn)變圓、脫落、裂解等明顯的細胞病變現(xiàn)象。收獲二次感染的細胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，取上清再次感染293細胞，進行病毒的大量擴增，使兩種基因型的重組腺病毒滴度約為109ML。研究表明，兩種重組病毒的包裝是成功的，并且均具有很高的滴度，能夠有效的感染293細胞，并有很強的GFP表達。按感染復(fù)數(shù)為5的標(biāo)準(zhǔn)，兩種基因型的腺病毒重組體分別感染HEPG2細胞。當(dāng)感染細胞培養(yǎng)至第5天時收集感染細胞及上清，細胞內(nèi)HBCAG及HBSAG經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測，均有蛋白表達。細胞及上清中的HBEAG和HBSAG用ELISA法進行檢測，結(jié)果可明確檢測到HBEAG及HBSAG的表達；上清及細胞內(nèi)病毒顆粒經(jīng)定量檢測后有明確的上升，說明我們所構(gòu)建的13拷貝HBVDNA能夠在HEPG2細胞內(nèi)進行表達和復(fù)制。分別用兩種不同HBV基因型的重組腺病毒感染HEPG2細胞，以后隔日收集感染細胞及清，并分別對上清中的病毒顆粒、HBEAG及HBSAG進行定性及定量檢測。感染第2天時，上清中即可檢測到病毒顆粒、HBEAG及HBSAG。感染第4天時上清中HBEAG及HBSAG的表達量最高，以后隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，HBEAG及HBSAG的表達量呈下降趨勢，HBEAG及HBSAG的表達量C基因型明顯高于B基因型。上清中病毒顆粒的量在第2天時即達最高值，然后隨培養(yǎng)時間的延長呈緩慢下降趨勢，但兩種基因型間病毒定量無差別。在本研究中，我們證明了腺病毒載體能夠?qū)⒕哂袕?fù)制能力的HBV基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝細胞系，并能啟動HBV復(fù)制導(dǎo)致完整的具有感染能力的HBV顆粒的產(chǎn)生，這說明導(dǎo)入的HBVDNA能在被轉(zhuǎn)染的細胞中復(fù)制。腺病毒介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染成功將為我們進一步研究病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制能力，比較不同的病毒株復(fù)制能力的差異，以及各病毒蛋白在病毒生活周期中的作用提供新的可靠途徑。本研究利用新型腺病毒系統(tǒng)在HBV基因型體外功能學(xué)研究方面的進行了初步嘗試。研究結(jié)果證明，腺病毒系統(tǒng)能作為HBV體外功能學(xué)研究和毒株之間比較研究的非常有效的工具。研究的初步結(jié)果顯示，B基因型和C基因型在體外復(fù)制過程中其抗原表達有差異，基因型C明顯高于基因型B，但病毒復(fù)制水平未見明顯差異。由于本研究只是比較了兩種基因型之間單一毒株的差異，這種初步結(jié)果有待進一步更深入的研究加以證實。

簡介：手足口病HFOOTMOUTHDISEASEHFMD是由腸道病毒感染引起的一種嚴(yán)重的傳染病并呈現(xiàn)逐年高發(fā)態(tài)勢。近年發(fā)現(xiàn)HFMD主要病原體為腸道病毒71型ENTEROVIRUS71EV71兒童為EV71易感人群。兒童感染EV71后臨床表現(xiàn)形式多樣除典型的HFMD外還常表現(xiàn)出嚴(yán)重的中樞神經(jīng)疾病及肺水腫和或肺淤血等并發(fā)癥嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。目前對于EV71感染引發(fā)HFMD的發(fā)生發(fā)展過程尚不清楚且缺乏有效的預(yù)防及治療方法常導(dǎo)致臨床醫(yī)療嚴(yán)重后果的發(fā)生因此明確HFMD病原全面分析EV71感染后病理改變探討發(fā)病機理以及研發(fā)安全、有效的HFMD疫苗成為預(yù)防和控制HFMD疾病暴發(fā)的有效手段之一。據(jù)此本論文從一例疑似HFMD的死亡案例出發(fā)從法醫(yī)病理學(xué)、分子病毒學(xué)、動物實驗等幾個方面對該病例及其致病病原EV71進行了深入的研究具體內(nèi)容有以下五個章節(jié)。第一章以文獻綜述的形式介紹了HFMD及EV71的研究背景主要包括HFMD的流行情況其主要病原體EV71的病毒學(xué)特點流行病學(xué)研究致病機理研究EV71感染的臨床診斷和治療疫苗的研究現(xiàn)狀實驗動物的選擇以及桿狀病毒表達系統(tǒng)的原理、技術(shù)路線及其作為基因工程疫苗載體的研究進展等。最后說明了本論文研究的內(nèi)容及意義。第二章利用常規(guī)法醫(yī)病理學(xué)分析方法對一例疑似HFMD致死案例進行了分析發(fā)現(xiàn)CNS病變明顯神經(jīng)細胞壞死、膠質(zhì)小結(jié)形成、炎細胞呈袖套樣浸潤肺水腫顯著、炎癥突出確認死因為病毒性腦炎及病毒性肺炎導(dǎo)致的急性呼吸、循環(huán)功能衰竭。在此基礎(chǔ)上利用RTPCR技術(shù)以國家CDC指導(dǎo)的EV71通用檢測引物證實病原體為EV71。隨后針對EV71保守區(qū)設(shè)計特異性引物進行巢式PCR擴增檢測了各病理組織的病毒載量利用抗EV71VP1蛋白的特異性多克隆抗體對石蠟切片進行免疫組織化學(xué)染色檢測了病毒抗原的組織分布。結(jié)果顯示此病例腦組織EV71病毒載量相對較高其中腦干和頸髓最高病毒抗原檢測陽性主要集中在CNS的神經(jīng)細胞及炎細胞為病毒感染復(fù)制的主要部位肺組織雖病變明顯水腫淤血突出但病毒核酸及抗原陰性并非病毒主要感染復(fù)制部位第三章自病毒載量最高的腦干組織出發(fā)在體外RD細胞上進行病毒的分離、傳代及空斑純化通過一步法生長曲線的方法了解不同株純化病毒的感染性差異同時利用EV71VP1基因的序列對病毒株進行基因分型。篩選出一株純化病毒擴增出核酸序列進行分段克隆獲得EV71病毒的全基因組并提交GENBANK。結(jié)果顯示腦干組織能成功分離到EV71XF活病毒在RD細胞上能產(chǎn)生腸道病毒特異性致細胞病變效應(yīng)CYTOPATHICEFFECTCPE透射電鏡能觀察到大小均勻、形態(tài)一致、直徑約2030NM的EV71病毒粒子。經(jīng)空斑純化后的四株病毒在體外RD細胞上感染性基本無差別VP1測序結(jié)果顯示均為C4亞型完成了一株病毒的全基因組測序基因組全長為7405BPGENBANK登錄號ACCESSIONNUMBER為JQ804832基因組序列提示此次感染病毒仍為國內(nèi)流行株C4亞型全基因組序列的測定將有利于后續(xù)的深入研究。第四章對純化的EV71XF病毒進行了建立小動物感染模型的初步摸索。通過顱腔注射INTRACRANIALINJECTIONIC的途徑使1日齡BALBC小鼠感染EV71XF病毒觀察其表現(xiàn)隔周采血對血清特異性抗體IGG及中和抗體進行檢測同時分離鼠腦組織中病毒再次接種1日齡小鼠獲得鼠適性毒株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1日齡BALBC小鼠能通過IC途徑感染EV71XF但無明顯的神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)血清抗體IGG在感染兩周后較高但仍處于亞中和抗體水平IC二次感染可以刺激小鼠產(chǎn)生更高濃度IGG并在RD細胞上表現(xiàn)出較好的特異性及交叉性中和保護作用母傳抗體的中和保護作用較強但時間短暫約4W齡時其保護作用消失反復(fù)多次鼠腦適應(yīng)可以得到感染性增強的鼠適株EV71XFAJQ但其毒力情況還需進一步研究。第五章利用桿狀病毒表達系統(tǒng)開展了EV71基因工程疫苗的初步研究。將編碼EV71XF的P1和3CD蛋白的基因分別克隆至PFASTBACDUAL載體的啟動子PPH和PP10下游的多克隆位點構(gòu)建重組PFASTBACDUALEV71XF3CDP1質(zhì)粒。重組質(zhì)粒與桿狀病毒BAC轉(zhuǎn)座后獲得重組BACBACEV71XF3CDP1。提取重組BACDNA轉(zhuǎn)染昆蟲SF9細胞獲得重組病毒重組病毒感染昆蟲細胞后表達的前體蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自組裝為病毒樣顆粒VIRUSLIKEPARTICLEVLPS經(jīng)蔗糖及氯化銫密度梯度離心進行初步的純化WESTERNBLOT檢測目的蛋白表達與剪切透射電鏡觀察VLPS顆粒另外還構(gòu)建了新的穩(wěn)定表達3CD的細胞系SF93CD用于VLPS的構(gòu)建策略。結(jié)果顯示重組桿狀病毒ACBACEV71XF3CDP1在SF9細胞內(nèi)能同時表達前體蛋白P1和蛋白水解酶3CD3CD能正確剪切P1蛋白成為VP1等結(jié)構(gòu)蛋白并自組裝為VLPS經(jīng)蔗糖及氯化銫密度梯度離心等初步純化后WESTERNBLOT顯示VLPS具有VP1的抗原表位透射電鏡觀察VLPS的形態(tài)、大小及構(gòu)象均類似于天然的EV71病毒粒子可以作為EV71疫苗的候選物。SF93CD細胞系能穩(wěn)定表達3CD蛋白并剪切P1形成VLPS可以作為構(gòu)建VLPS的新途徑。綜合以上研究內(nèi)容本研究完成了一例疑似HFMD案例的法醫(yī)病理學(xué)分析確定了其致病病原為腸道病毒EV71并從病理組織中分離、純化到一株高活性的EV71XF病毒完成了該病毒株的病毒感染活性檢測、全基因組序列測定、小鼠感染性試驗以及基因工程疫苗等初步研究。該研究為致死性EV71病毒感染的組織病變過程的解析和機理研究提供了重要的實驗數(shù)據(jù)也為EV71病毒的基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)對預(yù)防和控制HFMD的工作作出了重要貢獻。

簡介：目的在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，在導(dǎo)師以往臨床及實驗研究的基礎(chǔ)上，觀察解毒復(fù)肝湯聯(lián)合苦參素序貫給藥對不同基因型慢性乙型肝炎的血清病毒學(xué)指標(biāo)的影響，并從基因型的分析，探討其作用機理，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的慢性乙型肝炎患者98例，按照隨機對照的原則隨機分成2組，對照組32例在苦參素序貫給藥的基礎(chǔ)上加用甘利欣、門冬氨酸鉀鎂注射液，每日1次，應(yīng)用1個月，改為隔日靜脈滴注，再應(yīng)用7次后停藥。治療組66例在以上治療的基礎(chǔ)上加用解毒復(fù)肝湯。兩組療程均為3個月。觀察兩組患者之間及治療組中基因B型、C型患者治療前后臨床癥狀、體征，血清肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL，血清病毒學(xué)標(biāo)志HBSAG、HBEAG和抗HBE及HBVDNA水平的變化，比較兩組之間及治療組中基因B型和C型患者之間的療效。結(jié)果①兩組總體療效比較治療組66例中，顯效22例，有效35例，無效7例，脫落2例，總有效率為8906％。對照組32例中，顯效6例、有效17例、無效8例，脫落1例，總有效率為7419％。治療組的總體療效與對照組比較差異有顯著性P005。③兩組臨床癥狀、體征比較治療后兩組患者的主癥、次癥及體征積分值均明顯下降，與治療前相比，差異有顯著性P005。④兩組肝功能指標(biāo)的比較與治療前比較，兩組肝功能均有明顯改善，差異有顯著性P005。⑤兩組在觀察期間均未見不良反應(yīng)。結(jié)論解毒復(fù)肝湯聯(lián)合苦參素序貫給藥對不同基因型慢性乙型肝炎患者具有良好療效，可明顯改善患者的臨床癥狀、體征，療效確切，其作用機制可能與解毒復(fù)肝湯恢復(fù)肝臟功能、增強苦參素抗HBV活性等作用有關(guān)，其中對基因B型患者的療效優(yōu)于C型患者。

簡介：目的選用導(dǎo)師左俊嶺教授治療慢性乙型肝炎多年經(jīng)驗篩選的益腎解毒方，通過隨機對照臨床試驗，評價在慢性乙型肝炎病毒攜帶者免疫耐受狀態(tài)下使用本方益腎解毒干預(yù)的臨床療效及病毒學(xué)效應(yīng)。目的為探求在慢性乙型肝炎病毒攜帶者免疫耐狀態(tài)下應(yīng)用中醫(yī)藥治療的有效方法。方法采用隨機對照前瞻性的研究方法，收集2014年12月至2015年2月期間于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診，并符合標(biāo)準(zhǔn)的60名慢性乙肝病毒攜帶者，隨機分為兩組，治療組30人，對照組30人。治療組給予益腎解毒方治療。對照組不給于藥物治療。以12周為一療程。觀察并對比兩組患者的癥候積分、肝功能、乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志、乙肝病毒DNA載量的變化情況。結(jié)果經(jīng)過12周的治療，治療組的中醫(yī)癥狀有效率達90％，對照組的中醫(yī)候狀有效率為66％，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后，兩者具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜005），治療組對患者癥候積分的降低顯著優(yōu)于對照組P＜001。治療組治療后各項癥候積分均較治療前有緩解（P＜001）對照組患者治療前后脅肋部疼痛癥候積分未顯示統(tǒng)計學(xué)差異P＞005，其余癥候均有緩解（P＜005），兩組患者的AST、ALT、GGT、TBIL、DBIL等肝功能指標(biāo)，在治療前后均未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異（P＞005）。兩組患者的血清學(xué)標(biāo)志物在治療前后未顯示統(tǒng)計學(xué)差異（P＞005）。治療組中乙肝病毒DNA載量治療前后相比，治療后明顯下降，前后分別為560±179和475±186LOG10IUML，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異P＜001，說明益腎解毒方具有改善患者臨床癥狀及抑制乙肝病毒復(fù)制效果。結(jié)論經(jīng)過臨床隨機對照觀察，結(jié)果顯示益腎解毒方能夠有效地改善慢性乙型肝炎病毒攜帶者在免疫耐受狀態(tài)下的部分癥狀及體征，并且具有明顯的抗病毒效果。在目前乙肝免疫耐受狀態(tài)無可靠有效干預(yù)方法的現(xiàn)狀下，本研究所證實的中醫(yī)藥益腎解毒法應(yīng)用，可為臨床提供一種較為有益的治療手段。

簡介：點擊查看更多HBsAg定量對peg干擾素聯(lián)合LAM治療后持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測價值.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多147例慢性乙型肝炎患者NAs治療中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的臨床分析.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的分析慢性丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUS，HCV感染者基線的肝組織學(xué)活動指數(shù)HISTOLOGICALACTIVITYINDEX，HAI、TREG、TH17細胞及IL28BRS12979860基因型的特點探討三者與抗HCV快速病毒學(xué)應(yīng)答RAPIDVIROLOGICALRESPONSE，RVR可能的相關(guān)性。方法收集2012年8月至2013年6月天津市第三中心醫(yī)院門診診斷的慢性丙型肝炎患者63例，記錄臨床一般情況（年齡、性別、身高、體重、可能的感染途徑、既往病史、既往治療情況）、治療前臨床及影像學(xué)資料（血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂、甲狀腺功能、抗核抗體、HCVRNA載量、HCV基因分型、IL28BRS12979860基因型、肝膽胰脾及雙腎B超）。留取63例HCV感染者及同期健康體檢者新鮮外周血標(biāo)本。按患者意愿行肝穿活檢組織檢查者33例，留取標(biāo)本。所有標(biāo)本取材均通過我院倫理委員會審核，家屬知情同意并簽字。所有患者接受標(biāo)準(zhǔn)療法STARDOFCARE，SOC抗HCV治療，定期隨訪。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測63例慢性丙型肝炎CHRONICHEPATITISC，CHC患者外周血CD3T、CD4T、CD8T、CD4CD25FOXP3TREG細胞頻率，并與23例健康對照HEALTHYCONTROL，HC進行比較。通過肝穿刺組織HE染色HAEMATOXYLINEOSINSTAIN評價HAI、肝臟炎癥壞死分級GRADE，G及纖維化分期STAGE，S。免疫組織化學(xué)染色法IMMUNOHISTOCHEMISTRY，IHC標(biāo)記肝穿組織中FOXP3TREG細胞、IL17TH細胞TH17細胞。結(jié)果1CHC組外周血CD4T、CD4CD8、CD4CD25FOXP3TREG細胞頻率分別為2816±8295％、087±0392％、683±2209％，均高于HC組的2357±5492％、060±0120％、486±0740％P＜005，差異有統(tǒng)計學(xué)意義CHC組外周血CD3T、CD8T細胞頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2基線HCVRNA載量與浸潤肝組織的TREG細胞低度正相關(guān)R0353，P0047與HAI、外周血T細胞亞群、浸潤肝組織的TH17細胞、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALANINETRANSAMINASE，ALT水平均無相關(guān)性。3HCV感染者基線ALT水平與浸潤肝組織的TREG細胞呈低度負相關(guān)關(guān)系R0383，P0030與外周血T細胞亞群、浸潤肝臟的TH17細胞及HAI均無相關(guān)性。4HAI與浸潤肝組織的TREG細胞低度負相關(guān)R0443，P0010，與肝組織的TH17細胞低度正相關(guān)R0404，P0020，與外周血T細胞亞群無相關(guān)性。5隨著炎癥壞死分級的增加，肝組織TREG細胞數(shù)逐漸減少，肝組織TH17細胞數(shù)及HAI逐漸增加P＜005）而基線HCVRNA載量、ALT水平及外周血T細胞亞群，在各分級均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞005）。6隨著纖維化分期的增加，HAI逐漸升高P＞005）。肝組織TH17細胞在S1期1918±10597HPF低于S2與S3期，而在S2與S3期無明顯差異2800±14830HPFVS2678±15903HPF?；€HCVRNA載量、血清ALT水平、外周血T細胞亞群、肝組織TREG細胞在不同肝組織纖維化分期中，均無統(tǒng)計學(xué)差異P＞005。7基線HCVRNA、ALT、HAI、T細胞頻率，在脂肪變組與無脂肪變組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞005）。8IL28BRS12979860CC型與CT型相比，血清ALT水平、體重指數(shù)BODYMASSINDEX，BMI、胰島素抵抗指數(shù)HOMEOSTATICMODELASSESSMENTOFINSULINRESISTANCE，HOMAIR、外周血CD3T、CD4T、CD8T細胞頻率、CD4CD8比值、CD4CD25FOXP3TREG細胞頻率，HAI、炎癥壞死分級、纖維化分期、HCVRNA病毒載量、肝組織TREG細胞及TH17細胞，均無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞005。9基線HCVRNA載量、HOMAIR、HAI是慢性HCV感染者SOC治療達到RVR的獨立影響因素血清ALT水平、外周血T細胞亞群的頻率、肝組織TREG、TH17細胞及TREGTH17比值在RVR組與NRVR組間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論浸潤肝組織的TREG及TH17細胞與慢性HCV感染者肝組織的炎癥有關(guān)，TH17細胞與較重的肝組織纖維化有關(guān)。基線HCVRNA載量、HOMAIR、HAI是快速病毒學(xué)應(yīng)答的獨立影響因素。IL28BRS12979860基因型與血清ALT水平、HCVRNA載量、肝組織炎癥壞死、纖維化程度及RVR均無明顯相關(guān)性。

簡介：目的探討恩替卡韋治療慢性乙型肝炎（CHB）患者發(fā)生病毒學(xué)突破的相關(guān)危險因素。方法收集263例CHB感染者使用恩替卡韋（ETV）治療患者的病歷資料，做回顧性調(diào)查并分析患者的生化、病毒學(xué)、用藥史、依從性等指標(biāo)是否影響病毒學(xué)突破的發(fā)生，并分析相關(guān)指標(biāo)與ETV病毒學(xué)突破的關(guān)聯(lián)。結(jié)果263例患者，經(jīng)過24個月的隨訪觀察，24例發(fā)生病毒學(xué)突破，突破發(fā)生率為913％。其中HBEAG陽性和陰性病毒學(xué)突破率分別為1118、538，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0118）；既往有LAM使用史和無LAM使用史病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1495，513，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0007）；ETV10MG、05MG病毒學(xué)突破率分別為741，932，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P1000）；有肝硬化和無肝硬化患者病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1563，704，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0038）；依從性差和依從性好的患者病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為2941，611，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0000）；ETV初治時ALT低中高三個水平組病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為1024，648，1429，三個水平組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞005）；ETV初治時HBVDNA低中高水平組病毒學(xué)突破發(fā)生率分別為506、556、1842，低中水平組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞005），低、高水平組和中、高水平組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜005）。治療6個月時HBVDNA轉(zhuǎn)陰率越高，病毒學(xué)突破發(fā)生率越低。既往有拉米夫定（LAM）使用史的患者治療12個月時病毒學(xué)突破發(fā)生率為280，治療24個月時累積發(fā)生率為1495，發(fā)生病毒學(xué)突破的平均時間為（1988±476）個月；而初治時使用ETV在治療12個月時病毒學(xué)突破發(fā)生率為064，治療至24個月時發(fā)生率為513。結(jié)論既往有LAM使用史、ETV初治時HBVDNA＞107COPIESML、有肝硬化、依從性差是恩替卡韋發(fā)生病毒學(xué)突破的危險因素；治療6個月時HBVDNA轉(zhuǎn)陰率越高，病毒學(xué)突破發(fā)生率越低；既往有LAM使用史的患者較ETV初治的患者病毒學(xué)突破發(fā)生率高。

簡介：研究目的腸道病毒感染是導(dǎo)致兒童麻痹的重要病因除脊灰病毒外非脊灰腸道病毒中的許多血清型可引起麻痹河北省已連續(xù)11年無脊灰野病毒循環(huán)但在對急性弛緩性麻痹AFP病例的監(jiān)測中檢出許多疫苗來源的脊灰病毒及非脊灰腸道病毒NPEV該研究主要研究AFP病例的病毒學(xué)和流行病學(xué)特征為消滅脊灰工作及預(yù)防和控制由NPEV所致麻痹提供技術(shù)參考研究方法研究對象為19972002年河北省15歲以下兒童AFP病例監(jiān)測系統(tǒng)中所有AFP病例對AFP病例進行流行病學(xué)、病毒學(xué)及臨床特征的分析病例的臨床及流行病學(xué)資料來源于監(jiān)測系統(tǒng)中的個案表和隨訪表按世界衛(wèi)生組織WHO脊髓灰質(zhì)炎病毒檢驗手冊規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法采用RD、L20B及HEP2三種細胞進行病毒分離及型別鑒定脊灰病毒陽性分離物送國家脊灰實驗室采用PCRRFLP方法進行型內(nèi)鑒別

簡介：背景抗病毒是治療慢性乙型肝炎CHB的關(guān)鍵措施干擾素IFNΑ是主要的抗病毒治療藥物之一但IFNΑ治療CHB患者的療效差異較大。因此對IFNΑ療效的影響因素及預(yù)測指標(biāo)的研究尤為重要。大量研究顯示其療效受宿主因素、病毒因素及環(huán)境因素的影響宿主免疫遺傳背景的差異可能是導(dǎo)致IFNΑ治療個體化差異的重要原因之一。本研究旨在探討程序性細胞凋亡基因PD1兩個SNPS位點PD11、PD12與中國漢族CHB患者IFNΑ療效的相關(guān)性以期為個體化治療提供參考依據(jù)。方法采用前瞻性研究方法對135例初始抗病毒治療CHB患者的早期病毒學(xué)應(yīng)答情況進行評估并應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性PCRRFLP分析技術(shù)檢測患者PD11和PD12的單核苷酸多態(tài)性SNPS分別成功鑒別出AA、AG和GG三種基因型按基因型分組分析其與IFNΑ早期病毒學(xué)應(yīng)答的相關(guān)性。結(jié)果135例CHB患者IFNΑ治療獲得早期病毒學(xué)應(yīng)答為33例244％。1、PD11位點①三種基因型組間的性別Χ21105P0575、年齡F0519P0596、治療前ALT水平F0187P0829、治療前HBV病毒載量F0759P0470以及IFNΑ種類Χ20058P0971均無統(tǒng)計學(xué)差異。②早期病毒學(xué)應(yīng)答率在AA、AG和GG基因型組中分別為1430、3250和1300在AA、AG和GG基因型三組間存在差異Χ26258P0044。但早期病毒學(xué)應(yīng)答在AA和GG基因型組間無顯著性差異Χ20018P0893由于AA、GG基因型組樣本含量小而AA、GG基因型組間比較P0893故采用卡方分割法將AA基因型組、GG基因型組合并與AG基因型組進行卡方檢驗Χ26246P0012具有顯著差異所以可以認為AG基因型相對AA、GG基因型有較高的病毒學(xué)應(yīng)答率。2、PD12位點①三種基因型組間的性別Χ20518P0772、年齡F1180P0310、治療前ALT水平F1892P0155、治療前HBV病毒載量F1442P0240以及IFNΑ種類Χ20331P0848均無統(tǒng)計學(xué)差異。②早期病毒學(xué)應(yīng)答率在AA、AG和GG基因型組中分別為1820、3140和1430在AA、AG、GG基因型之間比較IFNΑ的早期病毒學(xué)應(yīng)答差異無統(tǒng)計學(xué)意義Χ23957P0138。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)PD11的SNPS可能是中國漢族CHB患者IFNΑ治療早期病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測指標(biāo)有待擴大樣本量后再證實。

簡介：一、研究目的探索中藥對SARS相關(guān)病毒學(xué)及免疫學(xué)的機理，以雞傳染性支氣管炎模型進行SARS相關(guān)病毒學(xué)研究，以ARDS模型進行SARS相關(guān)免疫學(xué)研究。1、探討雞傳染性支氣管炎病毒IBV的增毒傳代及幾種檢測方法，在體內(nèi)觀察加味升降散的抗病毒作用。2、體外細胞培養(yǎng)觀察加味升降散的抗病毒、抑制病毒作用，以病毒蝕斑定量測定法揭示其可能的抗病毒機理。3、建立小鼠ARDS模型及探討加味升降散改善ARDS模型小鼠血氣的作用。4、探討加味升降散對ARDS模型小鼠氧自由基及炎性介質(zhì)的影響，并揭示其可能的抗氧化機理及細胞免疫調(diào)節(jié)機制。5、探討加味升降散對ARDS模型小鼠T淋巴細胞亞群的作用，并揭示其可能的免疫調(diào)節(jié)機理。二、實驗步驟1、IBV的傳代并檢測2、加味升降散對雞傳染性支氣管炎體內(nèi)模型的影響3、IBV蝕斑減數(shù)實驗4、正常NIH小鼠動脈血氣分析、肺系數(shù)及百草枯LD50的測定5、小鼠ARDS模型的建立、加味升降散的急性毒性實驗及加味升降散對ARDS模型小鼠血氣的影響6、加味升降散對MDA、SOD、NO的影響7、加味升降散對IL1Β、IL2、IL6、IL8及TNFΑ的影響8、加味升降散對小鼠T淋巴細胞亞群的影響三、實驗方法1、按動物病毒學(xué)的方法接種傳代IBV，NDV干擾法及侏儒胚實驗均按動物病毒學(xué)的方法。RTPCR檢測方法按RTPCR試劑盒說明書操作，最終產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳產(chǎn)物進行紫外檢測并用MINIVISIONARYTM凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗結(jié)果。2、IBV尿囊液，凍溶后緩慢滴入雛雞雙鼻、雙眼，然后隨機分為正常組，模型組，陽性對照組，中藥大、中、小劑量，攻毒后10小時予以藥物治療，中藥大劑量組21、中劑量組11、小劑量組12濃縮，每只小鼠每天灌胃06ML，分兩次灌胃。陽性藥物組予更昔絡(luò)韋10MGKG，用蒸餾水配制后灌胃06ML只，正常組及模型組灌等體積蒸餾水。共觀察9天，期間主要觀察雛雞的癥狀、大小便、死亡等指標(biāo)。I3、雞胚成纖維細胞培養(yǎng)按文獻方法進行，培養(yǎng)一天后顯微鏡下觀察，細胞貼壁，滿視野見到致密的細胞單層即可以用于實驗。雛雞肺和氣管等組織研缽好后倒入生理鹽水，并離心取上清，每管加雙抗終濃度為1萬單位ML后稀釋為101～1099個稀釋度。將稀釋好的病毒接種于成纖維細胞上，放37℃、5％CO2的孵育箱中感作45～60分鐘。最后倒入配好的瓊脂糖，待凝固后將培養(yǎng)板倒過來，放在孵育箱中培養(yǎng)24～48小時。到時間觀察蝕斑形成情況并計蝕斑數(shù)。4、左手提取固定小鼠，右手持肝素鈉濕潤的注射器盲穿小鼠心臟，抽動脈血500UL左右，針頭迅速刺入橡皮塞，迅速送血氣分析儀分析，小鼠尸體開胸取肺，電子天平稱重，濕肺重除以體重乘以100得肺系數(shù)。百草枯LD50的測定按汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院謝仰民教授等的方法，將實驗小鼠分為4864MGKG、6144MGKG、768MGKG、96MGKG、120MGKG、150MGKG5個劑量組，一次性灌胃處理。共觀察14天，每日計死亡小鼠數(shù)，24小時內(nèi)死亡不計入統(tǒng)計范圍內(nèi)。實驗數(shù)據(jù)以寇氏法計算。5、1ARDS模型的建立將實驗動物分為5組，即正常組、攻毒后1天、2天、3天、4天組，每組小鼠一次性灌百草枯018ML造模。攻毒后每天采血檢測血氣。各組血氣結(jié)果進行比較分析。2加味升降散的急性毒性實驗將實驗動物分為空白對照組，中藥大、中、小劑量組，實驗前小鼠禁食不禁水12H后一次性灌不同濃縮度中藥03ML，空白對照組灌等體積蒸餾水。每天上、下午各觀察一次，連續(xù)觀察1周，觀察記錄受試小鼠活動、行為及死亡等情況，死亡小鼠及時進行尸檢。3加味升降散對血氣的影響將實驗動物分為正常對照組、模型組、中藥大、中、小劑量組，除正常對照組外一次性灌百草枯018ML造模，10小時后給藥治療，3天后抽動脈血測血氣。實驗結(jié)束時取肺臟用10％福爾馬林固定，進行切片、HE染色，結(jié)果用光鏡觀察并拍照。6、將實驗動物隨機分為5組，即正常對照組、中藥大、中、小劑量組，造模及治療方法同前。SOD、MDA、NO測定均按其試劑盒說明書進行，最后按公式計算。7、實驗動物分組及造模、用藥方法同前。IL1Β、IL2、IL6、IL8及TNFΑ檢測按試劑盒說明書進行，最后按公式計算。8、實驗動物分組及造模、用藥方法同前。實驗結(jié)束時摘除小鼠眼球取靜脈全血約05ML左右抗凝，取30UL全血于上樣管中，按T淋巴細胞亞群試劑盒說明書加CD3、CD4、CD83種熒光抗體，避光孵育15～30分鐘，加1ML已配制好的1溶血素，震蕩混勻后孵育10～15分鐘，澄清之后1000RPM離心5分鐘，去上清，加500ΜLPBS重懸，混勻后上機檢測。四、實驗結(jié)果1、盲傳3代IBV，經(jīng)NDV干擾法測定其滴度IBV的毒力在105～106之間。NDV的效價為11024。侏儒胚實驗其EID50為02毫升10566，這與NDV干擾試驗結(jié)果相符。RTPCR法檢測IBV病毒，證實病毒RNA擴增的大小約為1404BP，與預(yù)期值一致，說明擴增出的病毒為IBV病毒。2、攻毒第1天未見明顯異常，第2天出現(xiàn)輕微的癥狀，如精神不振，呆立等，第3天開始癥狀明顯，出現(xiàn)精神不振、咳嗽、甩鼻、抓鼻、引頸樣呼吸、打噴嚏、呆立、羽毛松亂、進食減少、少數(shù)有氣管羅音，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸困難。攻毒3～7天癥狀明顯，第8天開始癥狀減輕，雛雞開始活躍。攻毒第3天下午開始雛雞死亡，3～5天為死亡高峰期，第6天開始死亡減少，第8天始幾乎無死亡。3、成纖維細胞培養(yǎng)所用的方法是半胚法，細胞貼壁好、生長良好，培養(yǎng)時間短，可以提高效率。培養(yǎng)時間一般為24～48小時，本實驗采用培養(yǎng)1天后進行下一步實驗，細胞生長旺盛、形態(tài)良好。病毒接種于成纖維細胞后成功形成了蝕斑，我們把病毒稀釋了9個濃度，101～109，101～106稀釋度，模型組和藥物組比較差異顯著，用藥組蝕斑明顯減少。當(dāng)稀釋到107時藥物組蝕斑很少，故未進行統(tǒng)計。4、正常NIH小鼠動脈血PAO2KPA范圍為1077～14831207±127PACO2KPA范圍為305～626458±102；肺系數(shù)范圍％為041～076058±0099PQ經(jīng)口染毒LD50為87096MGKG。5、攻毒后第2天開始PAO2、PAO2FIO2等指標(biāo)均明顯下降，PACO2均顯著增高，與正常組比較，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＜001。6、SOD造模后指標(biāo)明顯下降，和正常組比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)，P＜001，用藥后指標(biāo)呈不同程度升高，和模型組比較，統(tǒng)計學(xué)差異明顯；MDA造模后指標(biāo)明顯升高，模型組與正常組比較，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，治療后指標(biāo)明顯下降，各中藥組與模型組比較，統(tǒng)計學(xué)差異非常顯著，P＜001；NO模型組指標(biāo)和正常組比較，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＜001，用藥后指標(biāo)不同程度下降，和模型組比較，有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P＜001。7、IL1Β模型組指標(biāo)顯著高于正常組，P＜001，大劑量組和中劑量組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；IL2模型組指標(biāo)顯著低于正常組，P＜001，大劑量組、中劑量組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，大、中劑量組與模型組比較，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＜001，小劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；IL6模型組和各中藥組與正常組相比，指標(biāo)均升高，P＜001，大、中、小劑量組與模型組比較，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＜001；IL8造模后指標(biāo)明顯上升，和正常對照組比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，經(jīng)治療后指標(biāo)不同程度下降，和模型組比較，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，說明治療后指標(biāo)明顯下降；TNFΑ模型組的指標(biāo)比正常組明顯升高，P＜001，各中藥組與模型組比較，統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P均＜001，大、中、小劑量比較，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，P＞005。8、CD3、CD4、CD8各指標(biāo)造模后明顯下降，與正常對照組比較，統(tǒng)計學(xué)差異均顯著，P＜001或P＜005。五、結(jié)論1、我們通過NDV干擾法、侏儒胚實驗、RTPCR法檢測盲傳3代的IBV病毒，明確了所傳病毒確為IBV病毒，其EID50為10566。2、加味升降散能抑制病毒，提高雛雞抵抗力，增強抗病毒能力，能較好地改善癥狀，減少死亡率，中藥有一定死亡保護作用。3、加味升降散能減少病毒蝕斑的形成，有較好的抑制病毒、抗病毒能力。4、受試藥物在設(shè)計的劑量范圍內(nèi)是安全的，對實驗動物無毒性；加味升降散能明顯改善模型小鼠血氣，有升高PAO2降低PACO2作用，并能減輕ARDS模型小鼠癥狀，改善模型小鼠病理損害。5、加味升降散有抗氧化作用，從而改善病理損害。6、加味升降散能夠增強巨噬細胞吞噬功能，抑制巨噬細胞體外分泌IL1、TNFΑ，并能抑制IL6、IL8的分泌，減少炎癥介質(zhì)等對機體的損害，減輕肺水腫，并促進IL2的分泌。本方有免疫調(diào)節(jié)作用。7、加味升降散可以糾正T細胞亞群紊亂狀態(tài)，促進T淋巴細胞增殖，刺激小鼠脾細胞分泌IL2，增強細胞免疫功能。

簡介：背景對慢性乙型肝炎的自然史研究表明，慢性HBV感染者病情進展和預(yù)后與HBV復(fù)制密切相關(guān)。高病毒血癥、HBEAG持續(xù)陽性、ALT水平高或反復(fù)波動是發(fā)生肝硬化的主要高危因素。自發(fā)性或經(jīng)抗病毒治療后HBEAG血清轉(zhuǎn)換，且HBVDNA持續(xù)轉(zhuǎn)陰和ALT持續(xù)正常者的生存率較高。在同樣的遺傳背景下，HBV病毒負荷是肝硬化患者發(fā)生HCC的最重要的高危因素。說明HBV活動復(fù)制是影響慢性HBV感染者轉(zhuǎn)歸的最重要因素，抗病毒治療是慢性乙型肝炎治療的關(guān)鍵所在。Α干擾素類和核苷類似物是目前被公認為有效的抗乙肝病毒藥物。和Α干擾素相比，核苷類似物其毒副作用少，耐受性好，使用方便，能應(yīng)用于不能使用干擾素的慢性HBV感染患者，是目前慢性乙型肝炎抗病毒治療研究的熱點。其中，阿德福韋酯與其他幾種核苷類似物比較，一方面具有耐藥率低的特點，治療1年未檢出阿德福韋酯耐藥株；另一方面，與拉米夫定、恩替卡韋及特比夫定無交叉耐藥。因此，阿德福韋酯在核苷類似物中有著特殊的地位，已代替拉米夫定成為一線抗乙肝病毒藥物之一。阿德福韋酯可明顯抑制HBVDNA復(fù)制，但其抑制作用在不同個體中差異較大，僅部分病例獲得完全應(yīng)答。影響阿德福韋酯抗乙肝病毒療效的因素不十分清楚。血清HBVDNA、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、HBEAG血清轉(zhuǎn)換是常用于抗乙肝病毒藥物療效評價的主要指標(biāo)。從理論上講，抗病毒療效主要受到藥物、HBV和人體免疫狀態(tài)三方面的影響，如用藥療程、HBV基因型、治療前HBVDNA含量及病毒變異及ALT水平等。目的本研究的主要目的在于評價阿德福韋酯對中國慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA的抑制效果，同時，研究HBV基因型、治療前HBVDNA載量、ALT水平、HBEAG狀態(tài)等與阿德福韋酯病毒學(xué)應(yīng)答的關(guān)系，為制訂個體化抗病毒治療方案提供重要參考信息。方法符合慢性乙型肝炎診斷及方案入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)病例56例，血清HBVDNA定量≥10拷貝／ML、血清ALT水平15且拷貝／ML，0274±114LOG拷貝／MLP拷貝／ML，ALT復(fù)常率達714％40／56，HBEAG血清轉(zhuǎn)換率196％9／46。286％16／56獲得完全應(yīng)答，其中HBEAG陽性／抗HBE陰性者7例，HBEAG陰性／抗HBE陽性者9例。說明阿德福韋酯能通過抑制HBV復(fù)制改善肝功能，促進HBEAG血清轉(zhuǎn)換。HBV基因型分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，52例患者中B型和C型分別占538％和462％，未發(fā)現(xiàn)其他基因型，說明B型和C型是本地區(qū)HBV感染的主要基因型。比較兩種基因型感染者的基線HBVDNA載量、ALT水平、HBEAG狀態(tài)等無明顯差異性分布，說明慢性HBV感染者的HBVDNA載量、ALT水平及HBEAG狀態(tài)與感染HBV基因型B型或C型無顯著相關(guān)。HBV基因型與阿德福韋酯療效的關(guān)系目前并不十分清楚。比較B型和C型感染者治療40周的療效發(fā)現(xiàn)，兩組HBVDNA載量的變化、ALT復(fù)常率及HBEAG血清轉(zhuǎn)換率無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，說明感染HBV基因型B型或C型對阿德福韋酯的療效相當(dāng)，療效不受基因型影響?；€HBVDNA拷貝／ML組及基線HBVDNA≥110拷貝／ML組的HBVDNA陰轉(zhuǎn)率分別為842％、405％P拷貝／ML和732±103LOG10拷貝／MLP拷貝／ML者，使用阿德福韋酯治療后的HBVDNA陰轉(zhuǎn)率、HBEAG血清轉(zhuǎn)換率及完全應(yīng)答率均較高?；€ALT水平≥5ULN者，使用阿德福韋酯治療后HBVDNA載量下降幅度、HBVDNA陰轉(zhuǎn)率明顯高于ALT水平較低者，說明基線ALT水平也是影響阿德福韋酯療效的因素之一，基線ALT水平越高，療效越好。但本研究未顯示ALT水平對完全應(yīng)答有明顯影響?；€HBEAG陰性組和HBEAG陽性組NHBVDNAN轉(zhuǎn)率分別為923％12／13和442％19／43P拷貝／ML和737±090LOG拷貝／ML，P拷貝／ML，ALT≥5倍正常值上限是取得療效的有利因素。感染HBV基因型B型或C型、HBEAG狀態(tài)、年齡、性別、HBV感染家族史等因素與阿德福韋酯的病毒學(xué)應(yīng)答無關(guān)。

簡介：目的分析乙肝病毒HEPATITISBVIRUS，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)RTI233V變異的演變規(guī)律及其與阿德福韋酯ADV耐藥的相關(guān)性。方法分析了9830例慢性HBV感染者血清樣本中HBVRTI233V變異的檢出率。選擇其中2例代表性患者的動態(tài)收集血清樣本，擴增HBVRT基因并克隆測序（＞20個克隆樣本）以觀察RTI233V變異的演變過程。構(gòu)建PTRIEXHBV11倍野生株WT、3種臨床變異株RTI233V、RTN236T、RTI233VRTN236T和定點回復(fù)突變株RTN236T復(fù)制子，瞬時轉(zhuǎn)染入HEPG2肝癌細胞，分別加入不同濃度梯度或最高濃度的拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV和替諾福韋TDF作用，采用實時熒光定量PCR法檢測不同藥物濃度作用后細胞培養(yǎng)上清中HBVDNA水平，分析變異病毒復(fù)制力與表型耐藥變化特點。結(jié)果9830例慢乙肝患者血清樣本中共檢出RTI233V位點變異28例，檢出率為028％，其中RTI233V單獨變異19例，與RTN236T等經(jīng)典耐藥變異聯(lián)合出現(xiàn)9例。該變異的檢出患者均有ADV治療史，其中16例571％接受ADV單藥治療6個月以上，12例429％接受包括ADV的多藥序貫聯(lián)合治療1年以上?；颊?相對病毒復(fù)制力與表型耐藥分析顯示，RTI233V變異株的復(fù)制力與野生株接近982％，RTN236T變異株則較野生株顯著降低554％RTI233VRTN236T變異株的相對病毒復(fù)制力為野生株的1004％，表明RTI233V變異可明顯恢復(fù)RTN236T變異株受損的復(fù)制力RTN236T、RTI233VRTN236T和RTI233V變異株對ADV的敏感性分別為野生株的1682，1528和1157，RTN236T和RTI233VRTN236T變異株對ADV耐藥，而RTI233V變異株對ADV仍然敏感，與RTN236T聯(lián)合變異對ADV耐藥性的影響不大?；颊?RTI233V變異株的相對病毒復(fù)制力為野生株的1025％對ADV的敏感性為野生株的1076。RTI233V變異株對ADV及LAM、ETV和TDF均敏感。ADV對臨床變異株RTI233VRTN236T和定點回復(fù)突變株RTN236TLAB的抑制率相似，進一步證實RTI233V變異株對ADV耐藥性影響不大。結(jié)論RTI233V位點變異與ADV應(yīng)答不佳相關(guān)，但不直接降低病毒對ADV的敏感程度，可以恢復(fù)經(jīng)典ADV耐藥病毒株的復(fù)制力，是一種復(fù)制力補償變異。

簡介：研究背景乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV感染呈世界件流行全球約20億人曾感染過HBV其中35億人為慢性HBV感染者每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌HCC。我國HBV感染率較高159歲人群的HBSAG陽性率為718％慢性HBV感染嚴(yán)重危害著我國人民的健康?？笻BV治療是慢性乙型病毒性肝炎CHRONICHEPATITISBCHB治療的關(guān)鍵拉米夫定LAMIVUDINELAM是最常用的抗HBV藥物之一它能有效抑制HBV復(fù)制減少肝臟的炎癥活動延緩或阻止肝臟疾病的進展減少肝癌的發(fā)生率。然而長期的LAM治療會篩選出YMDD變異株RTM204VIS從而產(chǎn)生了LAM的耐藥。阿德福韋酯ADEFOVIRDIPVOXILADV是阿德福韋的前體口服藥物除了可以有效地抑制HBV野生毒株復(fù)制體內(nèi)和體外研究都證實阿德福韋可以有效地抑制YMDD變異株的復(fù)制因而被廣泛應(yīng)用于LAM耐藥患者的救援治療。聚乙二醇干擾素Α2Α派羅欣PEGASYS是一種長效干擾素它的半衰期長一周一次的給藥可以提高治療末應(yīng)答和持久應(yīng)答率優(yōu)于傳統(tǒng)干擾素是LAM耐藥患者救援治療的一個可能選擇。研究表明使用ADV單藥治療后LAM耐藥患者體內(nèi)的YMDD變異株會逐漸消失野生株逐漸取代YMDD變異株成為HBV準(zhǔn)種中的優(yōu)勢株。使用派羅欣治療后LAM耐藥患者體內(nèi)的YMDD變異株將如何變化目前尚無相關(guān)報道。研究目的1、探討派羅欣治療后YMDD變異株的動態(tài)變化比較派羅欣及ADV作用下YMDD變異株動態(tài)變化之間的差異。2、探索停止LAM治療后YMDD變異株的演化情況及YMDD變異株的演化與抗HBV療效之間的關(guān)系。3、比較ADV單藥和聯(lián)合LAM治療LAM耐藥患者的臨床療效為選擇合適的抗HBV方案對LAM耐藥患者進行救援治療提供線索。研究方法1停止LAM治療后YMDD變異的逆轉(zhuǎn)11樣本來源所有患者均來自2005年到2008年間我科參加的ML18376臨床試驗LAM耐藥HBEAG陽性CHB患者以21的比例隨機分配到APEG組、BADV組兩組我科兩組入組患者分別為25例、15例。A組患者給予PEGASYS180ΜG1周治療48周停藥后隨防24周；B組患者給予ADV10MGD治療72周；所有患者在頭12周內(nèi)均聯(lián)合使用LAM100MGD治療。12HBVDNA抽提收集患者12周、16周、24周、48周、72周等時間點的系列血清用DNA抽提試劑盒QIAAMPDNABLOODMINIKIT從血清每個血清樣本使用量為200ΜL中提取HBVDNA。13HBVRT區(qū)的PCR擴增使用巢式PCR擴增HBVRT區(qū)第二輪PCR產(chǎn)物直接送上海英駿公司測序。14測序結(jié)果分析測序結(jié)果與GENBANK報道的AG基因型別的HBV序列進行同源件比對用HBVS區(qū)做進化樹來進行基因分型。序列比對用MEGA4軟件進行測序峰圖用CHROMAS軟件分析。15統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均使用SPSS130統(tǒng)計軟件進行分析率的比較用X2檢驗分析。所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗P2停止LAM治療后YMDD變異株的克隆演化21樣本來源所有4位患者均來自ML18376臨床試驗。22HBVDNA抽提、HBVRT區(qū)的擴增同前擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行回收回收產(chǎn)物一部分送上海英駿公司測序一部分用于下一步實驗。23HBVRT區(qū)的克隆分析將PCR純化產(chǎn)物與PMDTM19TVECT連接后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有AMPICILLIN、IPTG、XGAL的LB平板上進行藍白斑篩選。每個血清樣品隨機挑選30個白色克降在LB培養(yǎng)基中37℃225RPM振蕩培養(yǎng)6至8小時。經(jīng)PCR鑒定后將所有陽性菌液送上海英駿公司測序最終有來自18個血清樣本的370個克隆成功測序。3、阿德福韋酯單藥和聯(lián)合LAM治療LAM耐藥HBEAG陽性慢性乙型肝炎的療效比較對24例ADV單藥及28例ADV聯(lián)合LAM治療的LAM耐藥HBEAG陽性慢性乙型肝炎進行回顧性分析比較兩組患者在HBVDNA、ALT水平及HBVDNA檢測不到率、ALT復(fù)常率上的差異。結(jié)論1、停止LAM治療后野生株在HBV準(zhǔn)種中的比例會逐漸增加并最終取代YMDD變異株成為HBV準(zhǔn)種中的優(yōu)勢株。2、大多數(shù)患者體內(nèi)的YMDD變異株在停止LAM治療4周后發(fā)生逆轉(zhuǎn)RTL80VI、RTL180M等補償變異能減慢YMDD變異逆轉(zhuǎn)的發(fā)生。3、RTL80VI、RTL180M、RTM204VI三者通常連鎖發(fā)生于同一HBV毒株上且會在停止LAM治療后同步逆轉(zhuǎn)。4、ADV單藥或聯(lián)合LAM均是治療LAM耐藥HBEAG陽性CHB的有效方法總體來說聯(lián)合治療的療效要優(yōu)于單藥治療。5、即使出現(xiàn)了LAM耐藥在后續(xù)的治療中依然有必要聯(lián)合使用LAM來抗HBV治療值得進一步探討PEGASYS聯(lián)合LAM治療LAM耐藥患者的療效和安全性。