乙肝病毒基因型與亞型臨床特征及病毒學(xué)差異比較研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)基因組全長(zhǎng)僅為3200個(gè)堿基，包括4個(gè)相互重疊的讀框：前C/C基因、P基因、S基因和X基因。依據(jù)核苷酸序列異質(zhì)性≥8％可將HBV毒株分成不同的基因型。到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了8個(gè)HBV基因型：基因型A、B、C、D、E、F、G和H。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地帶且與基因型D有類似的基因特征，異質(zhì)性最為明顯的F型主要分布于南美及中美洲。HBV幾個(gè)主要的基因型中均發(fā)現(xiàn)基因亞型現(xiàn)象的存在。其中基因型A可分為A1-A33個(gè)亞型

2、；基因型B可分為B1-B44個(gè)亞型；基因型C可分為C1-C44個(gè)亞型；基因型D分為D1-D44個(gè)亞型；基因型F可分為F1、F2兩個(gè)亞型。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV/C1、HBV/C2是中國地區(qū)最普遍的HBV/C亞型，其中是HBV/C1占71％(393/512)，HBV/C2占27％(112/512)此外，在對(duì)全國血清樣本進(jìn)行基因分型的過程中，我們?nèi)我膺x取PCR-RFLP分型鑒定的基因型B、C、D樣本各3份進(jìn)行了全序列的測(cè)定以判斷該分型方法

3、的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以PCR-RFLP分型鑒定為基因型D的部分樣本測(cè)序后比較證實(shí)為基因型C，后來的研究顯示該種毒株在S區(qū)與基因型D相同，暫時(shí)命名為HBVC/D重組體。并根據(jù)其序列特征建立了該重組體的初步篩選方法。以初步篩選方法對(duì)來自甘肅的HBV血清樣本進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了7例該種重組體；選取其中部分樣本進(jìn)行HBV全基因序列的測(cè)定，測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組的存在。這種亞型均為HBV基因型C與基因D毒株的重組體。 因此，在中國大陸地區(qū)至少存在

4、3種HBV/C基因亞型：HBV/C1、HBV/C2、及HBV/C/D。如同基因型呈地域性分布的特點(diǎn)一樣，基因型C亞型在我國不同地區(qū)的分布也有很大差異。在北方地區(qū)，98％以上基因型C毒株均屬于C2亞型，C1亞型罕見；而在南方地區(qū)，55％基因型C毒株為C1亞型，C2占較小比例。HBVC1亞型與C2亞型在各省的分布情況為：北京2％(1/54)與98％(53/54)；山東1％(1/100)與99％(99/100)；云南13％(5/38)與87％

5、(33/38)；湖南19％(3/16)與81％(13/16)；廣東63％(47/75)與37％(28/75)；海南79％(53/67)與21％(14/67)。在東南地區(qū)的福建省，C1與C2的亞型的比例分別為1％(1/72)與99％(71/72)。在中國西部HBV慢性感染人群中，基因型C亞型的情況與其它地區(qū)不同。在甘肅地區(qū)，C亞型的分布比例：C1為1％(1/90)，C2為91％(82/90)，C/D重組體為8％(7/90)。 本研

6、究中還比較了兩種主要C基因亞型C1與C2感染者之間的臨床差異。人口學(xué)資料比較發(fā)現(xiàn)，C1亞型感染者年齡較C2亞型感染者小(31.6±12.4vs.34.4±12.0，p=0.03)。盡管C1亞型感染者較C2亞型感染者有較高的HBeAg陽性率，兩者之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組病例在性別比率、肝功能檢查(ALT水平及總膽紅素水平)及臨床診斷方面未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，HBV基因亞型存在的現(xiàn)象對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展的影響尚有待進(jìn)一步研究。 在本研究

7、的第二部分，為研究HBV基因型功能學(xué)的差異，使用了腺病毒載體將目的HBV基因?qū)胝婧思?xì)胞，對(duì)不同HBV基因型毒株的表達(dá)與復(fù)制進(jìn)行了比較研究。腺病毒(Adenovirus，Ad)分布廣泛，在許多哺乳動(dòng)物和禽類中都發(fā)現(xiàn)其存在。其中人的腺病毒有50種以上，但通常都較溫和，很少危及生命。腺病毒對(duì)于研究真核細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，RNA剪接加工，蛋白質(zhì)的合成以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化做出過重要的貢獻(xiàn)。腺病毒還具有高滴度、高穩(wěn)定性、高轉(zhuǎn)染效率、非致癌性等特點(diǎn)。此

8、外，對(duì)野生型腺病毒進(jìn)行基因工程改造而制作的重組病毒載體系統(tǒng)，作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體、重組疫苗和基因治療載體也得到了廣泛應(yīng)用。本研究運(yùn)用了一種新的重組病毒構(gòu)建方法AdEasyTM系統(tǒng)，在體外模型中研究不同基因型HBV病毒復(fù)制活性差異。首先，我們構(gòu)建了1.3拷貝HBV/B、HBV/C全基因組，在其5’末端包含增強(qiáng)子Ⅰ及增強(qiáng)子Ⅱ，復(fù)制起點(diǎn)，X及前C啟動(dòng)子基因，前基因RNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，特異多腺苷酸化位點(diǎn)以及完整的X開放讀框。這種結(jié)構(gòu)已被證明

9、能在肝臟細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行有效的復(fù)制。隨后，將1.3拷貝HBV全基因插入到重組病毒穿梭載體pAdTrack的多克隆位點(diǎn)中，該位點(diǎn)位于CMV啟動(dòng)子及綠色熒光蛋白(GFP)位點(diǎn)上游，利用該系統(tǒng)，一方面可通過表達(dá)的GFP在熒光顯微鏡下觀察重組病毒感染情況，另一方面，構(gòu)建的1.3拷貝HBV全基因能夠利用病毒自身的調(diào)控序列啟動(dòng)HBV的復(fù)制，避免了載體上的外源啟動(dòng)子對(duì)HBV復(fù)制及表達(dá)的影響。將重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架載體pAdeasy-1共轉(zhuǎn)化

10、E.coliBJ5183細(xì)菌使之內(nèi)重組。在細(xì)菌中發(fā)生同源重組后，選出重組質(zhì)粒并酶切鑒定，將鑒定出的重組質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ線性化后使用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過GFP可以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率和病毒的產(chǎn)生。得到重組腺病毒之后，進(jìn)行純化和擴(kuò)增，再使用兩種不同基因型HBV重組腺病毒感染HepG2細(xì)胞。使用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達(dá)情況，用美國雅培公司的化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀對(duì)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg

11、進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行定量分析；熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中HBV的滴度；免疫組化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBsAg及HBcAg的表達(dá)情況。 結(jié)果表明，從我國慢性乙肝病毒感染者血清中獲得的HBV基因型B和C毒株，并經(jīng)過全序列的測(cè)定確定其基因型。通過酶切與連接成功構(gòu)建了兩種基因型的1.3拷貝HBVDNA，克隆篩選后進(jìn)行序列測(cè)定，證實(shí)了兩種基因型1.3拷貝HBVDNA序列正確無誤。為確保所構(gòu)建的有復(fù)制能力的1.3拷貝HBVDNA在病毒復(fù)制過程中不受這些

12、重要位點(diǎn)的影響，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)核對(duì)，并與多株參考序列進(jìn)行比對(duì)，排除了有插入、缺失及重要位點(diǎn)突變的克隆。1.3拷貝HBVDNA序列經(jīng)雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，與腺病毒穿梭載體pAdTrack進(jìn)行連接，連接物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌，隨機(jī)挑取克隆，雙酶切法初步驗(yàn)證插入序列片段大小的正確性。重組穿梭載體再用YS1-YS2進(jìn)PCR擴(kuò)增后，NdeⅠ內(nèi)切酶消化，驗(yàn)證插入序列基因型的正確性。兩種基因型的重組穿梭載體分別被命名為AdTrack-HBV

13、-B和AdTrack-HBV-C；轉(zhuǎn)化感染受態(tài)細(xì)菌Adeasier-1感受態(tài)細(xì)胞得到兩種基因型的腺病毒重組體：pAdeasier-B和pAdeasier-C，PacⅠ酶切鑒定其正確性。大量提取的重組腺病毒質(zhì)粒pAdeasier-B和pAdeasier-C用PacⅠ酶切線性化后，用脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞轉(zhuǎn)染7-10天后，即可在熒光顯微鏡下看見明顯的GFP熒光，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光斑點(diǎn)數(shù)也隨之增多，在普通

14、顯微鏡下可見明顯的病毒蝕斑，293細(xì)胞也出現(xiàn)固縮、變圓、脫落、裂解等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象，結(jié)果證明了重組病毒的形成和擴(kuò)增。收獲轉(zhuǎn)染10天后的293細(xì)胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，再重新感染293細(xì)胞。感染2天后細(xì)胞即可看到GFP的表達(dá)，細(xì)胞也出現(xiàn)變圓、脫落、裂解等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象。收獲二次感染的細(xì)胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，取上清再次感染293細(xì)胞，進(jìn)行病毒的大量擴(kuò)增，使兩種基因型的重組腺病毒滴度約為109/ml。研究表明，兩種重組病毒的

15、包裝是成功的，并且均具有很高的滴度，能夠有效的感染293細(xì)胞，并有很強(qiáng)的GFP表達(dá)。按感染復(fù)數(shù)為5的標(biāo)準(zhǔn)，兩種基因型的腺病毒重組體分別感染HepG2細(xì)胞。當(dāng)感染細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)收集感染細(xì)胞及上清，細(xì)胞內(nèi)HBcAg及HBsAg經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，均有蛋白表達(dá)。細(xì)胞及上清中的HBeAg和HBsAg用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可明確檢測(cè)到HBeAg及HBsAg的表達(dá)；上清及細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒經(jīng)定量檢測(cè)后有明確的上升，說明我們所構(gòu)建的1.3拷貝

16、HBVDNA能夠在HepG2細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)和復(fù)制。分別用兩種不同HBV基因型的重組腺病毒感染HepG2細(xì)胞，以后隔日收集感染細(xì)胞及清，并分別對(duì)上清中的病毒顆粒、HBeAg及HBsAg進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。感染第2天時(shí)，上清中即可檢測(cè)到病毒顆粒、HBeAg及HBsAg。感染第4天時(shí)上清中HBeAg及HBsAg的表達(dá)量最高，以后隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，HBeAg及HBsAg的表達(dá)量C基因型明顯高于B基

17、因型。上清中病毒顆粒的量在第2天時(shí)即達(dá)最高值，然后隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)，但兩種基因型間病毒定量無差別。在本研究中，我們證明了腺病毒載體能夠?qū)⒕哂袕?fù)制能力的HBV基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝細(xì)胞系，并能啟動(dòng)HBV復(fù)制導(dǎo)致完整的具有感染能力的HBV顆粒的產(chǎn)生，這說明導(dǎo)入的HBVDNA能在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中復(fù)制。腺病毒介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染成功將為我們進(jìn)一步研究病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，比較不同的病毒株復(fù)制能力的差異，以及各病毒蛋白在病毒生活周期中的作用提供新