Exendin-4改善Aβ31-35所致小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞Per2異常表達(dá)及機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）作為常見的神經(jīng)退行性疾病之一，患者早期就出現(xiàn)明顯紊亂的晝夜節(jié)律，而這會進(jìn)一步加重AD患者后期的學(xué)習(xí)記憶損傷及認(rèn)知功能障礙。作為AD重要病理特征之一的β淀粉樣蛋白（Amyloid-beta protein， Aβ）異常沉積與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，近年來更被證實與晝夜節(jié)律紊亂也高度相關(guān)。per2基因作為晝夜節(jié)律系統(tǒng)的核心組成成分，在晝夜節(jié)律的產(chǎn)生及維持中發(fā)揮著重要作用，其異常表達(dá)

2、會導(dǎo)致晝夜節(jié)律紊亂的發(fā)生。然而Aβ對Per2（per2 mRNA和PER2蛋白的總稱）的影響及其中可能涉及的機(jī)制尚不明確。此外，近年來胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）的長效類似物如Exendin-4，已被證實對AD晝夜節(jié)律紊亂具有改善功效，然而Exendin-4能否改善表達(dá)紊亂的Per2及其中可能涉及的機(jī)制仍缺乏理論及實驗支持。
　　因此，本研究獨創(chuàng)性地以Exendin-4干預(yù)小鼠海

3、馬HT22神經(jīng)細(xì)胞，通過顯微鏡下觀察及MTT細(xì)胞毒性實驗證實Exendin-4對Aβ31-35所致細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞及存活率降低均有改善作用。并進(jìn)一步通過實時熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）及細(xì)胞免疫熒光染色法證實Exendin-4能顯著拮抗并部分逆轉(zhuǎn)由Aβ31-35所致Per2的異常表達(dá)，更初步揭示了胰高血糖素樣肽-1受體（Glucagon-like peptide-1 receptor， GLP-1R）在Ex

4、endin-4發(fā)揮保護(hù)作用中的重要作用。本文擬通過以上研究，為Exendin-4改善AD患者晝夜節(jié)律紊亂的研究提供進(jìn)一步的理論和實驗支持。
　　第一部分Aβ31-35引起小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞Per2異常表達(dá)
　　目的：
　　從細(xì)胞水平分別觀察不同劑量Aβ31-35對per2基因及PER2蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：
　　采用小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞作為研究對象，將小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞分為：對照組，（

5、0、1、2.5、5、10μM）Aβ31-35處理組。不同劑量Aβ31-35處理后的細(xì)胞存活率采用MTT細(xì)胞毒性實驗進(jìn)行檢測。Aβ31-35對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響采用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。不同CT（circadian time, CT）時間點Aβ31-35對per2 mRNA的影響采用RT-PCR檢測。在CT16時Aβ31-35對PER2蛋白的影響采用免疫熒光染色法進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：
　?。?）使用0、1、2.5、5、10

6、μM的Aβ31-35分別處理細(xì)胞24 h后，各處理組細(xì)胞存活率分別為（100.00±2.56）％、（98.07±2.56）%、（94.86±1.13）%、（85.06±2.40）%、（80.56±1.13）%，經(jīng)5、10μM Aβ31-35處理后細(xì)胞存活率與對照組相比顯著降低（P<0.05）。（2）經(jīng)5μM Aβ31-35處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞密度整體降低，胞體有輕微的渾濁，局部細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)皺縮甚至變圓。（3）經(jīng)1μM Aβ31-35

7、處理后， per2 mRNA在各CT時間的表達(dá)與對照組均無顯著差異。經(jīng)5μM Aβ31-35處理后， per2 mRNA在CT16時表達(dá)為（0.83±0.14），與對照組（1.24±0.14）相比顯著降低（P<0.05）。（4）在CT16時PER2蛋白的熒光強(qiáng)度為（60.25±3.25）%，與對照組（100.00±3.47）%相比也顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　5μM Aβ31-35會引起HT22神經(jīng)細(xì)胞Per

8、2的表達(dá)發(fā)生異常。
　　第二部分Exendin-4拮抗Aβ31-35所致小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞Per2異常表達(dá)
　　目的：
　　從細(xì)胞水平觀察經(jīng)Exendin-4預(yù)處理對5μM Aβ31-35所致HT22神經(jīng)細(xì)胞Per2異常表達(dá)有無改善作用。
　　方法：
　　HT22神經(jīng)細(xì)胞被分為：對照組，Aβ31-35處理組，Exendin-4預(yù)處理組，Exendin-4單獨處理組。在熒光倒置顯微鏡下觀察Exendin

9、-4能否改善5μM Aβ31-35引起的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。采用MTT細(xì)胞毒性檢測經(jīng)Exendin-4預(yù)處理5μM Aβ31-35引起的HT22神經(jīng)細(xì)胞存活率下降能否被逆轉(zhuǎn)。采用RT-PCR檢測Exendin-4對5μM Aβ31-35引起的HT22神經(jīng)細(xì)胞per2 mRNA表達(dá)水平降低的影響。采用免疫熒光染色檢測Exendin-4能否拮抗5μM Aβ31-35引起的HT22神經(jīng)細(xì)胞PER2蛋白表達(dá)降低。
　　結(jié)果：
　?。?/p>

10、1）經(jīng)100 nM Exendin-4預(yù)處理，細(xì)胞形態(tài)較5μM Aβ31-35處理組有明顯改善，細(xì)胞整體密度有所提高，胞體清澈透亮，形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。（2）經(jīng)Exendin-4預(yù)處理后細(xì)胞存活率為（94.73±2.18）%，與5μM Aβ31-35處理組（84.76±3.07）%相比有顯著提高（P<0.05）。（3）在CT16時，經(jīng)100 nM Exendin-4預(yù)處理后per2 mRNA的表達(dá)為（2.40±0.06），與5μM Aβ31-

11、35處理后相比明顯升高（P<0.05）。（4）在CT16時，經(jīng)100 nM Exendin-4預(yù)處理后PER2蛋白的熒光強(qiáng)度為（91.35±9.95）%，較5μM Aβ31-35處理后顯著升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　Exendin-4對Aβ31-35所致HT22神經(jīng)細(xì)胞Per2的表達(dá)異常具有拮抗作用。
　　第三部分Exendin-4通過上調(diào)GLP-1R拮抗Aβ31-35所致小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞Per2異

12、常表達(dá)
　　目的：
　　進(jìn)一步對Exendin-4顯著拮抗Aβ31-35所致HT22神經(jīng)細(xì)胞Per2異常表達(dá)中GLP-1R的作用進(jìn)行探討。
　　方法：
　　將HT22神經(jīng)細(xì)胞分為：對照組，Aβ31-35處理組，Exendin-4預(yù)處理組，Exendin-4單獨處理組，Exendin-4+Exendin(9-39)處理組，Exendin-4+Exendin(9-39)預(yù)處理組， Exendin(9-39)單獨處理組

13、。采用免疫熒光染色在CT16時檢測Exendin-4能否部分逆轉(zhuǎn)Aβ31-35所致HT22神經(jīng)細(xì)胞GLP-1R表達(dá)降低。使用Exendin(9-39)抑制GLP-1R后，采用免疫熒光染色檢測經(jīng)Exendin-4預(yù)處理能否逆轉(zhuǎn)由Aβ31-35所致HT22神經(jīng)細(xì)胞PER2蛋白表達(dá)降低。
　　結(jié)果：
　?。?）經(jīng)5μM Aβ31-35處理細(xì)胞后GLP-1R的熒光強(qiáng)度為（38.66±2.56）%，與對照組（100.00±1.37）%

14、相比顯著降低（P<0.05）；而經(jīng)100 nM Exendin-4預(yù)處理后GLP-1R的熒光強(qiáng)度（105.12±1.37）%較Aβ31-35處理組顯著升高（P<0.05）。（2）經(jīng)100 nM Exendin-4單獨處理后GLP-1R的熒光強(qiáng)度為（110.65±2.67）%，與對照組GLP-1R的熒光強(qiáng)度（100.00±2.49）%相比顯著升高（P<0.05）。而經(jīng)100 nM Exendin-4和10μM Exendin(9-39)共

15、同處理后GLP-1R的熒光強(qiáng)度為（99.11±0.89）%，與100 nM Exendin-4單獨處理后相比顯著降低（P<0.05）。（3）經(jīng)100 nM Exendin-4+10μM Exendin(9-39)預(yù)處理后PER2蛋白的熒光強(qiáng)度為（51.92±2.00）%，與100 nM Exendin-4預(yù)處理后（91.35±9.95）%相比顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　上調(diào)GLP-1R的表達(dá)極有可能是Exen