靶向ErbB2抗體H2-18與小分子抑制劑聯(lián)合應(yīng)用在Trastuzumab耐藥乳腺癌中的抗腫瘤作用及其機(jī)理.pdf

1、ErbB2（human epidermal growth factor receptor2，HER2）是人表皮生長因子受體家族成員。25-30％的乳腺癌細(xì)胞及4-50％的胃癌細(xì)胞存在著ErbB2過表達(dá)。ErbB2的過表達(dá)與腫瘤的侵襲及不良預(yù)后有著密切關(guān)聯(lián)。曲妥珠單抗(Trastuzumab)是一個(gè)靶向ErbB2的人源化抗體，已獲批用于ErbB2高表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌和胃癌的臨床治療。然而，臨床研究表明大部分ErbB2高表達(dá)的乳腺癌患者對Tr

2、astuzumab治療不產(chǎn)生反應(yīng)，即使對Trastuzumab產(chǎn)生反應(yīng)的患者有半數(shù)也會在1年內(nèi)產(chǎn)生耐藥。因此，發(fā)展新的乳腺癌靶向治療策略已成為基礎(chǔ)研究和臨床治療的迫切需求。
　　在前期研究中，我們通過篩選噬菌體抗體庫獲得了一株全新的抗ErbB2全人源單克隆抗體H2-18，其能夠強(qiáng)有力誘導(dǎo)Trastuzumab耐藥乳腺癌細(xì)胞發(fā)生程序化死亡(Programmed cell death，PCD)，而Trastuzumab則不能有效誘導(dǎo)乳

3、腺癌細(xì)胞發(fā)生PCD。我們通過乳腺癌荷瘤小鼠模型對H2-18的體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明H2-18能有效抑制Trastuzumab耐藥乳腺癌生長。我們的研究進(jìn)一步提示H2-18的PCD誘導(dǎo)活性是其對Trastuzumab耐藥乳腺癌產(chǎn)生抗腫瘤活性的重要原因。ErbB2過表達(dá)乳腺癌對Trastuzumab產(chǎn)生耐藥的機(jī)制有多種，其中一個(gè)非常重要的原因是PI3K/AKT信號通路的異常激活。PTEN缺失以及PIK3CA基因突變都能夠?qū)е翽I

4、3K/AKT信號通路異常激活。但這種異常激活可被PI3K抑制劑所抑制。GDC-0941是一個(gè)pan-PI3K的小分子抑制劑，因其在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出理想的抗腫瘤活性而備受關(guān)注。Src是一個(gè)屬于Src激酶家族的非受體酪氨酸激酶，是多條與Trastuzumab耐藥產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)胞信號通路共同的關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)。Saracatinib是Src的抑制劑，能夠在一定程度上使耐藥乳腺癌細(xì)胞對Trastuzumab的作用重新變得敏感。
　　為了進(jìn)一步提高H

5、2-18抗體在耐藥乳腺癌中的治療效果，在本研究中我們將探討H2-18與GDC-0941或Saracatinib的聯(lián)合抗腫瘤作用。首先，我們通過三維細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)檢測了H2-18與GDC-0941或Saracatinib聯(lián)用對ErbB2過表達(dá)的Trastuzumab敏感的乳腺癌細(xì)胞BT-474、SKBR-3和Trastuzumab耐藥的乳腺癌細(xì)胞HCC-1954、HCC-1419的體外生長抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)用H2-18與GDC-09

6、41在以上乳腺癌細(xì)胞中均能發(fā)揮比單藥更強(qiáng)的抗腫瘤作用。用CompuSynsoware軟件擬合之后發(fā)現(xiàn)H2-18與GDC-0941具有協(xié)同抗腫瘤活性。聯(lián)用H2-18與Saracatinib在這幾株乳腺癌細(xì)胞中也展現(xiàn)出類似的比單藥明顯增強(qiáng)的抗腫瘤作用。為了探討以上藥物聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤活性的原因，我們采用了蛋白印跡法檢測不同藥物處理下BT-474和HCC-1954細(xì)胞內(nèi)ErbB2下游信號通路的改變。我們發(fā)現(xiàn)，GDC-0941能夠有效抑制Ak

7、t的磷酸化，對ErK磷酸化影響較弱，且不影響p-JNK和p-c-jun。H2-18能夠明顯抑制Erk的磷酸化，促進(jìn)JNK/c-jun的磷酸化，對AKT磷酸化的抑制作用較弱。與H2-18單用相比，H2-18/GDC-0941聯(lián)用在抑制Erk活性或激活JNK/c-jun的能力上沒有明顯差別，但抑制p-Akt的能力有所增強(qiáng)。接下來我們用pAkt(S473)的Elisa試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)pAkt的含量。結(jié)果顯示，聯(lián)用H2-18和GDC-0941組

8、與單用GDC-0941組在抑制p-Akt的作用上并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。相似的，聯(lián)用H2-18與Saracatinib在ErbB2下游信號通路上也沒能顯示出比單藥更強(qiáng)的作用。下一步，我們采用AnnexinⅤ/PI雙染法進(jìn)行細(xì)胞染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物處理后乳腺癌細(xì)胞BT-474、SKBR-3、HCC-1954和HCC-1419的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單藥相比，H2-18與GDC-0941聯(lián)用組誘導(dǎo)以上乳腺癌細(xì)胞發(fā)生PCD的能力顯著

9、增強(qiáng)。而聯(lián)用H2-18與Saracatinib也顯示了比單藥更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞PCD的能力。我們還通過PI染色用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測藥物處理后細(xì)胞周期分布的改變。結(jié)果表明，在BT-474細(xì)胞中，與單藥相比，聯(lián)用H2-18與GDC-0941時(shí)發(fā)生G1期阻滯的細(xì)胞比例更高。而在HCC-1954細(xì)胞中，聯(lián)用H2-18與GDC-0941并未比單用GDC-0941顯現(xiàn)出更強(qiáng)的G1期阻滯作用。H2-18與Saracatinib兩藥聯(lián)用在Trastuzum

10、ab敏感的細(xì)胞株BT-474與SKBR-3細(xì)胞中較單藥組引起更明顯的G1期阻滯。而在Trastuzumab耐藥的細(xì)胞HCC-1954和HCC-1419中，聯(lián)用H2-18與Saracatinib也并未顯示出比單用Saracatinib更強(qiáng)的誘導(dǎo)G1期阻滯的作用。此外，我們用流式細(xì)胞技術(shù)檢測了藥物處理后BT-474和HCC-1954細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量。結(jié)果顯示，在這兩株細(xì)胞中，單用H2-18與GDC-0941都能增高活性氧水平。而與單用組相

11、比，H2-18/GDC-0941聯(lián)用組不能進(jìn)一步提高活性氧水平。類似的，H2-18/Saracatinib聯(lián)用組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平并不比H2-18單用組高。我們利用HCC-1954乳腺癌荷瘤小鼠模型對以上藥物進(jìn)行了體內(nèi)抗腫瘤作用研究，結(jié)果表明單用H2-18與單用GDC-0941都能有效抑制移植瘤的生長，而兩者聯(lián)用后比單藥組具有顯著增強(qiáng)的抑制腫瘤生長的作用。聯(lián)用H2-18與Saracatinib的情況與H2-18/GCD-0941相似。因此

12、，我們推斷無論是聯(lián)用H2-18與GDC-0941還是聯(lián)用H2-18與Saracatinib，它們較單藥組表現(xiàn)出更強(qiáng)抗腫瘤活性的原因可能主要由于藥物聯(lián)用可協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生PCD。除此之外，兩藥聯(lián)用后能同時(shí)抑制ErbB2下游關(guān)鍵的PI3K/AKT與RAS/MAPK兩條通路也發(fā)揮了一定的作用。
　　綜上所述，H2-18與GDC-0941或Saracatinib聯(lián)合應(yīng)用在Trastuzumab耐藥的乳腺癌中均展現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫