靶向HER2單克隆抗體H2--18在胃癌中的抗腫瘤作用及其機理.pdf

1、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)是一種酪氨酸激酶受體，該受體在多種類型的腫瘤中過表達(dá)，HER2過表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。曲妥珠單抗(Trastuzumab，Herceptin)是一株靶向HER2胞外段結(jié)構(gòu)域Ⅳ區(qū)的人源化抗體，已獲美國食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于HER2高表達(dá)的乳腺癌及胃癌的臨床治療。然而，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，大部分HER2高表達(dá)乳腺癌

2、患者對Trastuzumab不產(chǎn)生反應(yīng)（即原發(fā)性Trastuzumab耐藥），初期對Trastuzumab產(chǎn)生反應(yīng)的患者有半數(shù)也會在1年內(nèi)產(chǎn)生耐藥（即獲得性Trastuzumab耐藥）。在胃癌的治療中同樣存在這一情況。
　　帕妥珠單抗（Pertuzumab）是另一株靶向HER2胞外段結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)的人源化抗體。Trastuzumab和Pertuzumab具有協(xié)同的抗腫瘤作用，故二者聯(lián)合用藥被FDA批準(zhǔn)為一線治療方案。盡管臨床試驗證實T

3、rastuzumab和Pertuzumab的聯(lián)合用藥能部分克服Trastuzumab耐藥，但仍存在客觀反應(yīng)率及完全反應(yīng)率低的問題。因此，克服Trastuzumab的原發(fā)性及獲得性耐藥問題仍是基礎(chǔ)研究和臨床治療的迫切需求。
　　原發(fā)性Trastuzumab耐藥與獲得性Trastuzumab耐藥在發(fā)生機制上并不相同，在治療方案上也應(yīng)區(qū)別對待。前期研究中，課題組通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到一株新的抗HER2全人源單克隆抗體H2-18，該抗

4、體與HER2的胞外段結(jié)構(gòu)域Ⅰ區(qū)特異性結(jié)合，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)的方式克服原發(fā)性Trastuzumab耐藥。本課題中，一方面研究了H2-18在獲得性Trastuzumab耐藥細(xì)胞中的抗腫瘤作用，另一方面研究了H2-18與Trastuzumab、Pertuzumab聯(lián)用在胃癌中的抗腫瘤作用。
　　一、H2-18在獲得性Trastuzumab耐藥細(xì)胞中的抗腫瘤作用
　　將一

5、株Trastuzumab敏感胃癌細(xì)胞株NCI-N87培育成獲得性Trastuzumab耐藥細(xì)胞株NCI-N87-TraRT。鑒于H2-18克服Trastuzumab原發(fā)性耐藥的機制在于有效誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生PCD，首先通過AnnexinⅤ與PI雙染檢測藥物處理后細(xì)胞的死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NCI-N87及NCI-N87-TraRT細(xì)胞中，H2-18均能顯著的誘導(dǎo)細(xì)胞PCD，呈濃度依賴性，而其他抗體均不能產(chǎn)生這種作用。相比NCI-N87細(xì)胞，在

6、NCI-N87-TraRT細(xì)胞中H2-18能誘導(dǎo)更高比率的PCD。在BT-474與BT-474TraR細(xì)胞中也得到了相同的結(jié)果。隨后，通過增殖抑制實驗檢測藥物對NCI-N87及NCI-N87-TraRT細(xì)胞的體外增殖抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2-18對兩株細(xì)胞的增殖抑制作用并無差異。在NCI-N87細(xì)胞中，H2-18的增殖抑制作用弱于Trastuzumab單用，而在NCI-N87-TraRT細(xì)胞中，H2-18的增殖抑制作用超過了Trastu

7、zumab的單用。進一步通過裸鼠皮下移植瘤模型對藥物的體內(nèi)抗腫瘤作用進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NCI-N87細(xì)胞腫瘤模型中，H2-18的抑制腫瘤生長作用與Trastuzumab單用相近，但弱于Trastuzumab與Pertuzumab的聯(lián)用，而在NCI-N87-TraRT移植瘤模型中，H2-18的抑制腫瘤生長作用遠(yuǎn)強于Trastuzumab的單用，并優(yōu)于Trastuzumab與Pertuzumab的聯(lián)用。為了探討H2-18在獲得性Tras

8、tuzumab耐藥細(xì)胞中的抗腫瘤作用機制，使用蛋白印跡法檢測藥物對NCI-N87及NCI-N87-TraRT細(xì)胞HER2下游信號通路的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NCI-N87細(xì)胞中，H2-18對HER3、AKT、ERK的磷酸化能產(chǎn)生抑制作用，而在NCI-N87-TraRT細(xì)胞中，H2-18對HER3、AKT、ERK的磷酸化的作用微乎其微。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在兩株細(xì)胞中，H2-18均能引起細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Specie

9、s，ROS)的升高，同時伴JNK與c-jun磷酸化的上調(diào)，而當(dāng)使用ROS清除劑或使用SiRNA沉默JNK、c-jun后，H2-18誘導(dǎo)的細(xì)胞PCD均明顯下降。因此，推測在獲得性Trastuzumab耐藥細(xì)胞中，H2-18仍可通過RIP1-ROS-JNK-c-jun通路有效誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡，進而克服Trastuzumab的獲得性耐藥。
　　二、H2-18與Trastuzumab、Pertuzumab聯(lián)用在胃癌中的抗腫瘤作用
　　

10、首先通過蛋白印跡法及流式法對多株胃癌細(xì)胞HER2表達(dá)情況進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有在NCI-N87細(xì)胞株以及本實驗室自行培育的NCI-N87-TraRT細(xì)胞株中存在HER2的高表達(dá)。通過增殖抑制實驗檢測藥物聯(lián)用對胃癌細(xì)胞的體外增殖抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HER2高表達(dá)的NCI-N87及NCI-N87-TraRT細(xì)胞中，Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)用的增殖抑制作用要強于Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18

11、各自的單用，而Trastuzumab與H2-18聯(lián)用的增殖抑制作用超過了Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)用，H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者的聯(lián)用表現(xiàn)出最強的抑制活性。用CompuSynsoware軟件擬合之后發(fā)現(xiàn)H2-18與Trastuzumab聯(lián)用或H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者聯(lián)用均具有協(xié)同的抗腫瘤作用。而在HER2低表達(dá)的胃癌細(xì)胞中，均未發(fā)現(xiàn)這一這結(jié)果。進一

12、步使用平板克隆實驗檢測藥物聯(lián)用對細(xì)胞增殖能力的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NCI-N87細(xì)胞中，H2-18與Trastuzumab聯(lián)用較Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)用對克隆形成都有一定的抑制作用且作用效果相近，在NCI-N87-RraRT細(xì)胞中，H2-18與Trastuzumab聯(lián)用對克隆形成的抑制作用超過了Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)用，而在兩株細(xì)胞中，Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18

13、聯(lián)用均表現(xiàn)出最強的克隆形成抑制作用。同樣通過裸鼠皮下移植瘤模型對藥物聯(lián)用的體內(nèi)抗腫瘤作用進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩株細(xì)胞移植瘤模型中，H2-18與Trastuzumab聯(lián)用對裸鼠皮下移植瘤抑制作用均超過了Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)用，Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者聯(lián)用同樣表現(xiàn)出最強的腫瘤抑制作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中，抗體聯(lián)用組對HER3、AKT、ERK磷酸化的抑制要強于各抗體的

14、單用，H2-18與Trastuzumab聯(lián)用較Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)用對HER3、ERK、AKT磷酸化的抑制作用相近，Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者聯(lián)用對HER3、AKT、ERK的磷酸化表現(xiàn)出最強的抑制作用。更重要的是H2-18單用或是H2-18與Trastuzumab、Pertuzumab聯(lián)用均能引起細(xì)胞PCD，同時伴ROS升高以及JNK、c-jun磷酸化的上調(diào)，而Trastuzu

15、mab與Pertuzumab的單用或是聯(lián)用均不能引起ROS-JNK-c-jun通路的改變。因此，推斷H2-18與Trastuzumab、Pertuzumab聯(lián)用均具有協(xié)同抗腫瘤作用的機制在于同時抑制胃癌細(xì)胞下游PI3K/AKT及RAS/MAPK信號傳導(dǎo)通路以及H2-18通過HER2胞外Ⅰ區(qū)有效誘導(dǎo)細(xì)胞PCD。
　　綜上所述，H2-18與Trastuzumab、Pertuzumab聯(lián)用在Trastuzumab耐藥的胃癌中均展現(xiàn)出良好