二色補(bǔ)血草LbGST基因的克隆與功能分析.pdf

1、植物谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases)家族在植物逆境反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過程中都起著非常重要的作用。本研究從二色補(bǔ)血草cDNA文庫(kù)中分離出一條谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因,將其命名為L(zhǎng)bGST(FJ620899)。該基因cDNA全長(zhǎng)987 bp,其中5'端含非編碼區(qū)29 bp,3'端含非編碼區(qū)307 bp,開放閱讀框全長(zhǎng)651 bp,共編碼216個(gè)氨基酸,該基因編碼蛋白的分子量為24.5 kDa,理論等電點(diǎn)為5.

2、98,為酸性蛋白。氨基酸序列分析表明,LbGST蛋白與其他植物GST的同源性較低。
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)研究不同脅迫條件下,LbGST基因在二色補(bǔ)血草中的表達(dá)模式。結(jié)果表明,LbGST能夠應(yīng)答NaCl、NaHCO3、PEG6000以及低溫脅迫。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,LbGST-GFP蛋白分布在細(xì)胞核內(nèi)。
　　 構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-LbGST,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中。利用0.1mmol/

3、L的IPTG誘導(dǎo)該基因在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示,重組表達(dá)載體的大腸桿菌在50 kDa處出現(xiàn)了特異的融合蛋白,與預(yù)期結(jié)果一致,證明了GST與LbGST融合蛋白的表達(dá)。
　　 將LbGST基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2中,形成重組質(zhì)粒pYES2-LbGST,將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母NVSc1中驗(yàn)證LbGST基因在不同非生物脅迫下的抗逆能力。結(jié)果表明LbGST基因?qū)Χ喾N脅迫(NaCl、NaHCO3、低溫、P

4、EG、高溫和紫外線)具有耐受能力。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證LbGST基因在鹽脅迫下的功能,將其轉(zhuǎn)入煙草中。隨機(jī)選取5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行NaCl脅迫試驗(yàn),分析逆境脅迫條件下非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性,丙二醛(MDA)、脯氨酸以及Na+、K+離子含量等指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示,鹽脅迫下多數(shù)轉(zhuǎn)基因煙草的GST、GPX