RARα和NLS-RARα蛋白的細(xì)胞生物學(xué)功能分析及其作為轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分?jǐn)y帶RARα基因的重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對人白血病細(xì)胞的影響
　　目的：用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建人RARα基因重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒,感染人白血病細(xì)胞株NB4后用一定濃度的全反式維甲酸ATRA誘導(dǎo),觀察其對白血病細(xì)胞株增殖、分化和凋亡的影響，同時與變異型NLS-RARα的細(xì)胞生物學(xué)功能相比較，觀察二者的生物學(xué)功能差異。
　　方法：以白血病細(xì)胞株NB4的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增RARα基因，克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTra

2、ce-TO4中,構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4-RARα。用限制性內(nèi)切酶EcoR V和Sal I雙酶切及測序鑒定，然后轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒AdEasy-1的大腸桿菌BJ5183菌株的感受態(tài)，同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒Ad-RARα。酶切驗(yàn)證后，限制性內(nèi)切酶Pac I酶線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝出重組腺病毒Ad-RARα，經(jīng)3輪擴(kuò)增后，測定病毒滴度，進(jìn)行PCR鑒定。流式細(xì)胞術(shù)測定病毒感染效率，Western blot法

3、檢測重組腺病毒感染的人NB4細(xì)胞中RARα蛋白，CCK-8法檢測重組腺病毒感染對NB4細(xì)胞增殖的影響，Annexin V/PI雙染法測定細(xì)胞周期，PI測定細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4-RARα構(gòu)建成功，病毒感染效率可達(dá)70％,與對照組的NB4細(xì)胞相比,重組腺病毒感染的NB4細(xì)胞內(nèi)RARα蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05),且經(jīng)一

4、定濃度全反式維甲酸ATRA處理后,能夠有效地促進(jìn)感染重組腺病毒細(xì)胞的分化成熟和凋亡，變異蛋白NLS-RARα與之相比，NLS-RARα亦能促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，抑制分化。
　　結(jié)論：變異蛋白NLS-RARα與野生型RARα在白血病細(xì)胞株中過表達(dá)后均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞分化，在經(jīng)一定濃度的維甲酸誘導(dǎo)后均能促進(jìn)細(xì)胞分化成熟和凋亡，故得出結(jié)論：變異蛋白NLS-RARα與野生型RARα的細(xì)胞生物學(xué)功能相似，NLS-RARα可能通過與野生

5、型RARα類似的功能影響白血病細(xì)胞株的細(xì)胞生物學(xué)功能。
　　第二部分RARα和NLS-RARα的結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究
　　目的：通過研究NLS-RARα的結(jié)合位點(diǎn)，與RARα的結(jié)合位點(diǎn)相比較，證明NLS-RARα為一個變異的轉(zhuǎn)錄因子，可能與RARα競爭性結(jié)合某些基因而參與到APL的發(fā)生中。
　　方法：構(gòu)建維甲酸受體α（RARα）、視黃醛受體α（RXRα）及變異蛋白NLS-RARα的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過間接免疫熒光（I

6、FF）觀察 RARα、RXRα和 NLS-RARα的核漿分布，然后用免疫共沉淀（Co-IP）分別檢測RARα、NLS-RARα同RXRα是否有相互作用；凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測RARα、NLS-RARα結(jié)合維甲酸反應(yīng)元件DNA探針的能力；最后用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測RARα和NLS-RARα調(diào)控維甲酸反應(yīng)元件活性的程度。
　　結(jié)果：維甲酸受體α（RARα）、視黃醛受體α（RXRα）的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；間接免疫熒光結(jié)果顯

7、示，與 RARα相比， NLS-RARα更多地分布在細(xì)胞核內(nèi)；免疫共沉淀和 Native-PAGE結(jié)果顯示NLS-RARα與RXRα有相互作用，并能夠形成二聚體；凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明NLS-RARα能夠結(jié)合維甲酸反應(yīng)元件DNA探針及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論：該研究成功地構(gòu)建了RARα、RXRα的真核表達(dá)質(zhì)粒，并證明NLS-RARα有轉(zhuǎn)錄活性，NLS-RARα可能作為一個變異的轉(zhuǎn)錄因子參與影響白血病細(xì)胞株的增殖